硫化氫在腎臟纖維化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分單側(cè)輸尿管梗阻大鼠硫化氫合成酶表達(dá)及血漿硫化氫濃度變化
　　目的：觀察經(jīng)典腎臟纖維化模型—單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型（unilateral uretheral obstruction，UUO）腎臟組織中硫化氫合成酶—胱硫醚-β-合成酶（cystathionineb-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）的蛋白表達(dá)及血漿H2S濃度的變化。
　　方法：SD大鼠分成假

2、手術(shù)組（sham組）和左側(cè)輸尿管梗阻組（UUO組）。造模兩周后處死動物，使用HE染色評價兩組大鼠腎臟小管間質(zhì)損傷程度，Masson染色評價腎間質(zhì)膠原纖維面積，western blot測定腎皮質(zhì)CBS和CSE的蛋白表達(dá)。使用硫化氫熒光探針（DNZ-As）測定兩組大鼠血漿硫化氫濃度。
　　結(jié)果：與正常大鼠對比，UUO模型大鼠造模兩周后腎皮質(zhì)CBS表達(dá)明顯下降，而CSE代償性升高，血漿H2S較正常大鼠下降。
　　結(jié)論：UUO損傷導(dǎo)

3、致了腎臟硫化氫合成關(guān)鍵酶CBS表達(dá)下降，CSE代償性升高，血漿H2S濃度下降，表明H2S參與了UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化的病理過程。
　　第二部分外源性硫化氫對UUO大鼠腎臟纖維化的干預(yù)作用
　　目的：探討外源性硫化氫治療UUO的療效和安全劑量范圍。
　　方法：應(yīng)用不同濃度H2S供體（NaHS）、依那普利、CBS抑制劑（aminooxyacetate，AOAA）和CSE抑制劑（propargylglycine，PAG）干預(yù)

4、 UUO大鼠，通過大體外觀、病理染色、免疫組化和蛋白印跡等方法評價藥物干預(yù)對腎間質(zhì)纖維化的影響。實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組（sham）、UUO組、UUO+10mg/kg/d依那普利組、UUO+5.6mg/kg/d NaHS組、UUO+56mg/kg/d組、UUO+560mg/kg/d組、UUO+5mg/kg/d AOAA組、UUO+25mg/kg/d PAG組。所有干預(yù)在術(shù)前三天給藥，NaHS、AOAA和PAG為腹腔注射，依那普利為灌胃，給藥持

5、續(xù)至術(shù)后14天。
　　結(jié)果：與UUO組比較，依那普利、5.6mg/kg/d NaHS和56mg/kg/d NaHS改善了腎間質(zhì)纖維化（P<0.05），表現(xiàn)為腎臟體積縮小，腎皮質(zhì)厚度增加。HE染色腎間質(zhì)小管損傷評分下降，Masson染色腎間質(zhì)膠原纖維沉積減少，腎皮質(zhì)Fibronectin(FN)和a-SMA表達(dá)下調(diào)。56mg/kg/d NaHS抗纖維化效果與依那普利相當(dāng)，且優(yōu)于5.6mg/kg/d NaHS。560mg/kg/d N

6、aHS、AOAA和PAG未能表現(xiàn)出抗纖維化作用。
　　結(jié)論：劑量NaHS能夠減輕UUO大鼠模型的腎臟間質(zhì)纖維化。該效應(yīng)起于5.6mg/kg/d，達(dá)峰于56mg/kg/d，翻轉(zhuǎn)于560mg/kg/d。
　　第三部分硫化氫對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　目的：觀察硫化氫能否減輕腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK49F）的增殖和分化。
　　方法：
　　（1）培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，同步化后細(xì)胞分成對照組、NaH

7、S組、TGF-b1組和NaHS聯(lián)合TGF-b1組，分別處理12小時和24小時后，使用RT-PCR及Western blot測定各組細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的mRNA及蛋白表達(dá)。
　?。?）同步化后細(xì)胞分成對照組、NaHS組、10%FBS組和NaHS聯(lián)合10%FBS組，培養(yǎng)24小時后使用MTT法、Brdu染色和western blot觀察NaHS對細(xì)胞數(shù)目、DNA合成以及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的的影響。
　　結(jié)果：表明2ng/ml TGF

8、-b1刺激細(xì)胞12h后細(xì)胞內(nèi)collagen-I、FN和a-SMA mRNA表達(dá)上調(diào)，24小時后FN和a-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。NaHS(100mmol/L)預(yù)處理0.5h后collagen-I、FN和a-SMA mRNA表達(dá)和FN和a-SMA蛋白表達(dá)較2ng/ml TGF-b1單獨(dú)刺激組明顯下降（P<0.05）。MTT法表明與10%FBS單獨(dú)刺激細(xì)胞增殖24小時后細(xì)胞數(shù)目明顯增多，NaHS(10～100μM)預(yù)處理0.5

9、h后降低了FBS所致的細(xì)胞數(shù)目增多（P<0.05），上述抗增殖效應(yīng)在NaHS100μM最為明顯。BrdU滲入法表明10%FBS刺激細(xì)胞增殖5h后，細(xì)胞核內(nèi)DNA滲入明顯增加。與FBS組相比，NaHS100μM預(yù)處理0.5h降低了細(xì)胞核內(nèi)的DNA滲入。進(jìn)一步研究表明10%FBS刺激細(xì)胞增殖24小時后細(xì)胞內(nèi)PCNA和C-myc等增殖相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。與FBS組相比，NaHS100μM預(yù)處理0.5h降低了PCNA和C-myc的蛋白表達(dá)（P<0

10、.05）。
　　結(jié)論：NaHS能夠通過抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的分化和增殖而發(fā)揮抗纖維化作用。
　　第四部分硫化氫減輕腎臟纖維化的機(jī)制研究
　　目的：探討NaHS抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）應(yīng)用2ng/ml TGF-b1刺激NRK-49F不同時間（0.5-2h）。通過western blot方法檢測TGF-b1信號通路中Smad3和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activate

11、d Protein Kinase,MAPK）信號通路中ERK、P38和JNK磷酸化。然后在此時間基礎(chǔ)上，加用NaHS100μM預(yù)處理0.5h，觀察信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子及相關(guān)蛋白磷酸化水平的變化。
　?。?）使用二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，評價NaHS能否抑制TGF-b1導(dǎo)致的NRK49F細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。
　　（3）腎臟皮質(zhì)CD68染色評價NaHS能否抑制腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)果

12、：
　?。?）2ng/ml TGF-b1刺激細(xì)胞后，P38磷酸化于0.5h達(dá)高峰，Smad3為1小時，ERK和JNK為2小時，此后下降。選擇2ng/ml TGF-b1刺激細(xì)胞1小時為時間點(diǎn)，NaHS100μM預(yù)處理0.5h，與TGF-b1單獨(dú)刺激組相比，細(xì)胞內(nèi)Smad3、ERK、P38和JNK蛋白磷酸化水平下降（P<0.05）。
　?。?）NaHS抑制了TGF-b1刺激的細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度。
　　（3）與UUO組比

13、較，依那普利、5.6mg/kg/d NaHS和56mg/kg/d NaHS減少了腎臟皮質(zhì)CD68陽性染色的細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)論：NaHS能夠通過通過抑制腎內(nèi)炎癥和ROS的產(chǎn)生，以及抑制TGF-b1和MAPK兩條致纖維化信號通路抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化。
　　綜上所述，H2S能夠減輕UUO大鼠的腎臟纖維化，其劑量效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為“鐘形”曲線。離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)H2S能夠抑制腎臟成纖維細(xì)胞的分化和增殖。H2S抗纖維化的機(jī)制與抑制