苜蓿黃酮對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、瘤胃代謝和免疫性能影響的研究.pdf

1、紫花苜蓿是我國(guó)最重要的栽培牧草，廣泛分布于西北、華北等地區(qū)，因具有品質(zhì)好、產(chǎn)量高以及適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)而被稱為“牧草之王”。黃酮類化合物是苜蓿中一種主要的生物活性物質(zhì)。雖然黃酮的研究報(bào)道較多，但對(duì)苜蓿黃酮在動(dòng)物上的研究還較少，其作用機(jī)理在許多方面還不清楚。目前，苜蓿黃酮對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能及其機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、瘤胃代謝和免疫性能的影響及其機(jī)理，為開(kāi)發(fā)利用苜蓿黃酮提供科學(xué)依據(jù)。
　　試驗(yàn)一、苜蓿黃酮

2、對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)的影響
　　本試驗(yàn)為了研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)的影響。試驗(yàn)選取4頭裝有瘤胃瘺管的初產(chǎn)奶牛（平均體重為500±25 kg，泌乳天數(shù)為79±6 d），采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。飼喂奶牛全混合型日糧，每組分別添加0g(A組)、20 g（B組）、60 g（C組）和100 g（D組）的苜蓿黃酮。試驗(yàn)期為4期，每期為24 d，其中10d預(yù)飼期。結(jié)果為:1）與試驗(yàn)A組相比，試驗(yàn)C組的干物質(zhì)采食量和

3、乳糖率顯著提高(P＜0.05)，而乳脂率則降低。乳蛋白率、總固形物和體細(xì)胞數(shù)量均隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高呈降低趨勢(shì)(0.05＜P≤0.10)。苜蓿黃酮提高了產(chǎn)奶量、4％標(biāo)準(zhǔn)乳和乳料比，但各組間無(wú)顯著差異。2）隨著苜蓿黃酮添加水平的升高，粗蛋白和中性洗滌纖維的消化率呈線性升高趨勢(shì)(0.05＜P≤0.10)。3)隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，血清中總蛋白(TP)和堿性磷酸酶(ALP)含量呈降低趨勢(shì)(P=0.08);試驗(yàn)C組血清中總膽固醇(T

4、C)高密度脂蛋白(HDL)含量最高。4）與試驗(yàn)A組相比，試驗(yàn)D組血清T3和T4濃度顯著升高（P＜0.05）。血清中的催乳素(PRL)濃度隨苜蓿黃酮添加劑量的升高呈升高趨勢(shì)。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠提高奶牛的采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，調(diào)節(jié)激素的分泌以及乳糖、乳脂和乳蛋白的合成。
　　試驗(yàn)二、苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與組成的影響
　　本試驗(yàn)研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與組成的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)一。結(jié)果如下

5、:1）苜蓿黃酮降低乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的含量，但各組之間無(wú)顯著性差異。2）試驗(yàn)C組細(xì)菌門和屬總數(shù)以及ACE、Chao和Shannon指數(shù)均顯著高于試驗(yàn)A和B組(P＜0.05)。3）在門和綱水平，隨著苜蓿黃酮添加量的升高，軟壁菌門和柔膜菌綱豐度、廣古菌門(P=0.04)及甲烷微菌綱(P=0.06)豐度呈線性升高趨勢(shì)，而梭桿菌門的梭桿菌綱(P=0.04)豐度和藍(lán)細(xì)菌門的4C0d-2綱(P=0.07)則降低;試驗(yàn)C組裝甲菌門的豐度顯著高于試

6、驗(yàn)A和B組(P＜0.05)。4)在屬水平，試驗(yàn)C組的Mogibacterium和錐形桿菌屬的豐度顯著低于試驗(yàn)A組(P＜0.05)，而假單胞菌屬的豐度顯著高于試驗(yàn)B組(P＜0.05)。試驗(yàn)D組羅氏菌屬的豐度顯著高于試驗(yàn)C組(P＜0.05)，而薩特菌屬則顯著低于試驗(yàn)B組(P＜0.05);隨著苜蓿黃酮添加量的升高，無(wú)甾醇支原屬、琥珀酸菌屬、產(chǎn)吲哚薩頓菌屬和螺旋體屬的豐度呈線性下降趨勢(shì)(0.05＜P＜0.10)。結(jié)果說(shuō)明，苜蓿黃酮能夠提高瘤胃細(xì)

7、菌的豐富度和多樣性，但對(duì)瘤胃發(fā)酵無(wú)顯著影響。
　　試驗(yàn)三、苜蓿黃酮對(duì)奶?？寡趸兔庖咝阅艿挠绊?br>　　研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛免疫性能的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)一。結(jié)果為:1）隨著苜蓿黃酮的添加劑量的升高，奶牛血液中性粒細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞比例、血小板數(shù)量和血小板壓積升高，而淋巴細(xì)胞數(shù)量則降低。2）試驗(yàn)B組奶牛血清中Ig G含量、CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值以及GM-CSF、IL-4和IFN-γ相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各

8、組(P＜0.05)，而CD8+T淋巴細(xì)胞比例的結(jié)果則相反。3)與試驗(yàn)A組相比，試驗(yàn)D組的GSH-Px活性升高(P＜0.05)，試驗(yàn)B組的CAT活性顯著升高，而試驗(yàn)C組的MDA含量顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血液免疫細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子的活性以及提高抗氧化能力來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫性能。
　　試驗(yàn)四、苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳成分合成的影響
　　本試驗(yàn)研究苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳成

9、分合成的影響。將乳腺上皮細(xì)胞分成5組，每組培養(yǎng)基中分別含有0（對(duì)照組）、25、50、75和100μg/mL苜蓿黃酮，細(xì)胞在條件為37℃，5％CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果為:1)培養(yǎng)96 h時(shí)，75μg/mL組的細(xì)胞增殖能力顯著高于其他各組(P＜0.01或P＜0.05)。2)與對(duì)照組相比，50μg/mL組細(xì)胞的GSH-Px、CAT活性和NO含量顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而LDH活性顯著降低(P＜0.01);75μg/mL組細(xì)胞的M

10、DA顯著降低(P＜0.01)。3）與對(duì)照組相比，25μg/mL組顯著降低LAT1、AK2、S6K1、mTOR、4EBP1、eIF4E、FATP1、FATP4、β-1,4-Gal T和HK2的表達(dá)(P＜0.01)，但能顯著提高ACACA和Glut8的表達(dá)(P＜0.01或P＜0.05);50μg/mL組顯著提高了PPAR-γ、 FATP4、SCD1、FABP3和FAS的表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠提高細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)

11、胞增殖;能夠調(diào)節(jié)乳脂、乳蛋白和乳糖合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)乳成分合成。
　　試驗(yàn)五、苜蓿黃酮對(duì)高溫下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響
　　本試驗(yàn)研究苜蓿黃酮對(duì)高溫下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響。將乳腺上皮細(xì)胞分成5組，每組培養(yǎng)基中分別含有0（對(duì)照組）、25、50、75和100μg/mL苜蓿黃酮，同時(shí)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃，5％ CO2培養(yǎng)48 h，再在42℃恒溫水浴鍋中水浴處理1h后返回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，檢測(cè)細(xì)胞活性、抗氧化指標(biāo)和

12、相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示:1）添加25μg/mL組的細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組和50μg/mL組(P＜0.05)，其他各組之間差異不顯著。2）相對(duì)于對(duì)照組，50～100μg/mL組細(xì)胞的GSH-Px活性升高(P＜0.01)，LDH和MDA含量降低(P＜0.01或P＜0.05)，而CAT活性無(wú)顯著性差異。3）相對(duì)于對(duì)照組，75μg/mL組細(xì)胞Caspase3、P53和Socs3基因表達(dá)降低(P＜0.01)，Stat3和Socs1基因表達(dá)升高(

13、P＜0.05);25μg/mL組Stat1基因表達(dá)升高(P＜0.05)。苜蓿黃酮對(duì)細(xì)胞Bcl-2和Fas基因表達(dá)無(wú)顯著影響。綜上所述，在高溫下，苜蓿黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化能力和抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高細(xì)胞的活性。
　　試驗(yàn)六、苜蓿黃酮對(duì)脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡和乳成分合成的影響
　　本試驗(yàn)研究苜蓿黃酮對(duì)脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡和乳成分合成的影響。將乳腺上皮細(xì)胞分成3組，每組培養(yǎng)基中分別0μg/mL的

14、LPS和苜蓿黃酮(對(duì)照組，Con)、1μg/mL的LPS(L)、1μg/mL的LPS和75μg/mL的苜蓿黃酮(L+F)，細(xì)胞在條件為37℃，5％ CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果為:1）在LPS刺激下，培養(yǎng)12h和24 h的細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而添加苜蓿黃酮能夠提高培養(yǎng)12h的細(xì)胞活性(P＜0.05)。2)在LPS刺激下，細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度顯著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黃酮能夠顯著降低ROS濃度(P＜0.01)

15、。3）在LPS刺激下，細(xì)胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4和MyD88基因的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黃酮能夠顯著降低IL-1β和TLR2基因的表達(dá)(P＜0.01)。4）在LPS刺激下，細(xì)胞P53、P38和Caspase3蛋白的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黃酮能夠顯著降低P53和P38的表達(dá)量(P＜0.05)。5）在LPS刺激下，細(xì)胞的PPAR-γ、 SCD1、FAB3、κ-CS、JAK2和mT

16、OR的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，SREBP1、CAT1和eIF4E表達(dá)量顯著升高(P＜0.01或P＜0.05);而添加苜蓿黃酮能夠顯著提高PPAR-γ、 S6K1、Glut1、Glut4和Glut8的表達(dá)量(P＜0.01或P＜0.05)和降低FA TP1和eIF4E表達(dá)量(P＜0.05)。結(jié)果表明，LPS能夠促使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，降低細(xì)胞活性，而苜蓿黃酮能夠抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。LPS能夠抑制乳蛋白和乳脂的合成