TGEV感染的ST細胞mRNA和lncRNA表達譜變化及其功能預(yù)測.pdf

1、豬腹瀉病是制約我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展最為突出的一類疾病，其中由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）所致的豬腹瀉病，即豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE），流行范圍廣、危害大。目前TGE防治成效仍不理想，主要原因是對TGEV感染致病機制和宿主應(yīng)答反應(yīng)還缺乏足夠的認識。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc

2、RNA）是新發(fā)現(xiàn)的一類具有重要生物學(xué)功能的分子，與細胞分化、個體發(fā)育和疾病發(fā)生關(guān)系密切，是生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c。然而，迄今關(guān)于lncRNA是否在TGEV感染致病過程中發(fā)揮作用尚未見報道，對TGEV感染后宿主功能基因的應(yīng)答反應(yīng)及其機制也知之甚少。因此，本研究以豬睪丸（ST）細胞為試驗材料，利用高通量測序技術(shù)揭示TGEV感染誘導(dǎo)的ST細胞mRNA/LncRNA表達譜變化，挖掘差異表達mRNA/lncRNA，再通過生物信息學(xué)手段分析預(yù)測差異

3、表達mRNA/lncRNA在病毒感染過程中的功能，試圖從mRNA和lncRNA兩個角度探索ST細胞對TGEV的應(yīng)答反應(yīng)機制。本研究包括以下三方面：
　?。?）TGEV感染ST細胞早期和后期轉(zhuǎn)錄組文庫的建立和高通量測序：將ST細胞分別用TGEV感染處理0h、6h和48h（每組3次生物學(xué)重復(fù)），分別代表未感染、感染早期和感染后期3個階段，依次標(biāo)記為MOCK、ST-TGEV-6h和ST-TGEV-48h。每組混合提取總RNA，構(gòu)建RNA

4、文庫；利用RNA-seq技術(shù)對3組文庫進行高通量測序。結(jié)果每組樣品均獲得了千萬級數(shù)量的clean reads，其中50％以上的reads可以比對上參考基因組，這說明測序的通量確實高，大量的測序數(shù)據(jù)為后續(xù)的生物信息學(xué)分析提供了良好的基礎(chǔ)。
　?。?）TGEV感染早期和后期ST細胞中差異表達mRNA的篩選分析：篩選組間差異表達的mRNA并進行KEGG和GO分析，分析差異mRNA在TGEV感染早期和后期參與的生物進程和信號通路；隨機選取

5、16個差異mRNA利用熒光定量PCR進行驗證，檢驗測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示在TGEV感染早期，篩選得到436個差異表達的mRNA（ST-TGEV-6h比較MOCK），其中388個上調(diào)，48個下調(diào)；在TGEV感染后期，篩選到308個差異表達的mRNA（ST-TGEV-48h比較ST-TGEV-6h），其中182個上調(diào)，126個下調(diào)。差異mRNA的GO分析結(jié)果顯示，差異mRNA廣泛參與了細胞免疫、疾病、能量代謝、核酸代謝和組織發(fā)育等過程。

6、本研究著重關(guān)注TGEV感染與細胞免疫的關(guān)系，通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)：在TGEV感染早期，ST細胞激活了TNF，溶酶體和吞噬體等信號通路參與免疫應(yīng)答；在感染后期，差異mRNA在 Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和細胞凋亡等多個通路中富集。結(jié)合測序結(jié)果和熒光定量PCR對Toll樣受體信號通路中的基因表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)TGEV感染激活了Toll樣受體信號通路中的TLR3信號通路，刺激了β干擾素（Interferon-β，IFN-β

7、）的表達。
　?。?）TGEV感染早期和后期ST細胞中差異表達lncRNA的篩選分析：篩選組間差異表達的lncRNA并隨機挑選25個差異lncRNA進行靶基因預(yù)測，結(jié)合mRNA測序及生物信息學(xué)分析結(jié)果，解析差異lncRNA在TGEV感染過程中的作用。隨機選取8個差異lncRNA，利用熒光定量PCR進行驗證，檢驗測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，在TGEV感染早期有23個表達差異的已知lncRNA，其中上調(diào)15個，下調(diào)8個；病毒感染后期有

8、67個差異已知lncRNA，其中上調(diào)7個，下調(diào)60個。LncRNA的靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，7差異個lncRNA具有 trans作用的靶基因，其中l(wèi)ncRNA LOC100524077預(yù)測的下游靶基因中SPP1和PKD2在TGEV感染過程中表達水平差異顯著。此外，對測序數(shù)據(jù)進行分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)共有8142個新lncRNA表達，其中有4個新lncRNA在TGEV感染早期差異表達，4個新lncRNA在TGEV感染后期差異表達。熒光定量PCR檢測結(jié)

9、果與高通量測序結(jié)果相符，說明lncRNA篩選結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　總之，通過高通量測序技術(shù)，本研究揭示了TGEV感染誘導(dǎo)的ST細胞mRNA和lncRNA表達譜變化；發(fā)現(xiàn)TGEV感染誘導(dǎo)的ST細胞差異表達mRNA參與了數(shù)千種生物進程，且TGEV感染早期可激活TNF、溶酶體和吞噬體等免疫相關(guān)信號通路，后期還激活了TLR3/IFN-β信號通路，從而誘導(dǎo)IFN-β表達以發(fā)揮抗病毒免疫應(yīng)答作用，對TGE防治具有重要參考價值；發(fā)現(xiàn)lncRNA