梅毒患者外周血單個核細胞microRNA表達譜檢測及其靶基因功能預測分析.pdf

1、背景：
　　梅毒是由梅毒螺旋體感染引起的慢性、性傳播疾病。梅毒螺旋體能夠侵襲人體全身多個器官和系統(tǒng)，給患者帶來巨大傷害。二期梅毒為梅毒螺旋體感染的急性期，會出現(xiàn)皮疹、脫發(fā)、粘膜斑、全身淋巴結(jié)腫大，甚至出現(xiàn)內(nèi)臟、眼和神經(jīng)系統(tǒng)損害等;梅毒螺旋體感染會侵犯骨骼、心血管、中樞神經(jīng)等系統(tǒng)，引起被侵犯器官的不可逆性損害。侵犯神經(jīng)中樞系統(tǒng)引起的神經(jīng)梅毒帶來的危害巨大，而目前對于其診斷仍然存在挑戰(zhàn)，值得關(guān)注。很多研究表明miRNAs在多種疾病的發(fā)

2、生發(fā)展中有重要調(diào)控作用，并在疾病的診斷以及預后中有重要的應(yīng)用價值。目前，沒有關(guān)于梅毒患者外周血單個核細胞miRNA表達譜及其臨床應(yīng)用的報道。本研究采用miRNA芯片檢測二期梅毒和神經(jīng)梅毒患者外周血單個核細胞的miRNAs表達譜，篩選出若干差異表達顯著的miRNAs，并通過real-time qPCR技術(shù)驗證結(jié)果的準確性，為深入研究miRNAs在梅毒的發(fā)病機制中的作用以及進一步研發(fā)miRNAs作為神經(jīng)梅毒的診斷標記物奠定基礎(chǔ)。
　　

3、目的：
　　探討miRNAs在梅毒感染中的調(diào)控作用及在其分子分型中的潛在應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1.采用miRNA表達譜芯片技術(shù)檢測8例二期梅毒患者、6例神經(jīng)梅毒患者和5例健康體檢者的外周血單個核細胞的miRNAs的差異表達，結(jié)合生物信息學技術(shù)篩選出顯著差異表達的miRNAs;
　　2.采用美國ABI公司設(shè)計合成的miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物和表達分析探針，通過Real-time qPCR方法在30例正常人、31例二

4、期梅毒和33例神經(jīng)梅毒患者中驗證芯片篩選的差異表達的miRNAs，鑒定芯片的可靠性;
　　3.通過targetscan、miRDB、RNA22三個數(shù)據(jù)庫預測差異表達miRNAs的靶基因，并選擇三個數(shù)據(jù)庫共同支持的靶基因進行GO分析和KEGG pathway分析，為深入研究其生物學功能奠定理論基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1.通過microRNA基因芯片檢測三組樣本中miRNAs表達譜，以及生物信息差異基因分析和聚類分析共篩選

5、出39條在神經(jīng)梅毒中顯著差異表達的miRNAs(P＜0.05)，其中18條miRNAs上調(diào)，21條miRNAs下調(diào)，二期梅毒中此39條miRNAs表達水平介于兩者之間，提示可能存在特異性的miRNA可以作為診斷神經(jīng)梅毒的分子標記物;
　　2.實時熒光定量PCR驗證13條差異表達的miRNAs，13條差異表達的miRNAs表達趨勢在各組之間與芯片結(jié)果一致，因此芯片結(jié)果的驗證率為100％，芯片結(jié)果具有較高的可靠性;
　　3.利用

6、targetscan、miRDB和RNA22三個miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預測靶基因，取靶基因交集后發(fā)現(xiàn)39條miRNAs共有靶基因5489個;
　　4.對預測的靶基因進行GO分析后發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控的靶基因在生物進程上主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過程調(diào)控、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、蛋白結(jié)合、細胞凋亡、程序性死亡等過程;而在細胞組成上，靶基因主要定位于細胞膜、細胞質(zhì)以及細胞內(nèi)的細胞器等部位;其參與的分子功能主要集中于金屬離子的結(jié)合、核苷酸分子的

7、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的激活等方面;
　　5.針對預測的靶基因進行KEGG pathway分析后，發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控的靶基因主要參與細胞凋亡、B細胞信號通路、內(nèi)吞作用、焦點粘連、白細胞經(jīng)內(nèi)皮遷移通路、趨化因子信號通路、T細胞信號等通路;
　　6.預測miR-21-3p靶基因參與機體重要的免疫調(diào)節(jié)信號通路，下調(diào)機體免疫，推測其在梅毒感染過程中協(xié)助梅毒螺旋體的長期潛伏，形成慢性感染。
　　結(jié)論：
　　本研究通過miRNA

8、芯片技術(shù)在二期梅毒和神經(jīng)梅毒患者PBMC中篩選出39條差異表達的miRNAs，并且通過熒光定量PCR探針法擴大檢測臨床樣本后驗證芯片結(jié)果具有較高的可靠性;39條差異表達的miRNAs在三組之間差異明顯，可以有效區(qū)分神經(jīng)梅毒，提示miRNAs可能可以用于梅毒的分子分型，為進一步尋找外周血的miRNAs作為神經(jīng)梅毒的診斷和預后的標記物奠定了重要基礎(chǔ);生物信息學預測了了差異表達的miRNAs靶基因，并分析其潛在的生物學功能及相關(guān)的分子機制。初