間接共培養(yǎng)對牙髓干細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、研究背景與目的
　　在口腔組織工程研究中，人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)作為成體干細(xì)胞，都被證實可以促進(jìn)頒面部硬組織的缺損修復(fù)，對于口腔組織再生有較大意義。然而，hDPSCs與hUCMSCs在細(xì)胞來源、體外培養(yǎng)難度、增殖能力、多向分化能力等方面各有優(yōu)劣

2、，在一定程度上限制了他們的研究與應(yīng)用。因而，探索優(yōu)化現(xiàn)有干細(xì)胞如hDPSCs與hUCMSCs等的生物學(xué)特性的方法很有意義。
　　細(xì)胞的旁分泌是指細(xì)胞分泌的各種調(diào)節(jié)因子進(jìn)入到細(xì)胞間隙，對鄰近的其他細(xì)胞的生物學(xué)特性起調(diào)控作用。大量研究表明，干細(xì)胞具備旁分泌功能，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子、外泌體等物質(zhì)可以影響到周圍包括組織細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞，對他們的增殖、粘附、凋亡等諸多行為起著不同的影響效應(yīng)。近年來更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不同種類

3、的干細(xì)胞之間同樣可以通過旁分泌作用相互影響增殖、分化等能力，如果能對這些改變加以利用，可能會對推進(jìn)干細(xì)胞在組織工程中的研究進(jìn)程有潛在價值。已有研究證實，hDPSCs和hUCMSCs都具有旁分泌功能，然而二者通過旁分泌對彼此生物學(xué)特性的影響尚不清楚。
　　利用Transwell嵌套建立的細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系是研究旁分泌的有力模型，可以更好模擬體內(nèi)環(huán)境中兩種細(xì)胞同時相互影響的狀態(tài)。因此，本實驗利用Transwell嵌套，于體外建立hDP

4、SCs與hUCMSCs的間接共培養(yǎng)體系，以初步探究間接共培養(yǎng)環(huán)境中hDPSCs與hUCMSCs的旁分泌對彼此增殖及成骨分化能力的影響。本實驗旨在為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的利用提供理論依據(jù)，為優(yōu)化hDPSCs與hUCMSCs在口腔組織工程中的應(yīng)用提供新的思路。
　　材料與方法
　　1.利用酶消化組織塊法分離、培養(yǎng)原代hDPSCs與hUCMSCs;利用流式技術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志，利用成骨、成脂誘導(dǎo)檢驗多向分化潛能;進(jìn)行hDPSCs與h

5、UCMSCs的傳代與凍存、復(fù)蘇。
　　2.建立hDPSCs-hUCMSCs體外間接共培養(yǎng)體系，并設(shè)置上下層含同種細(xì)胞的體系作為對照。間接共培養(yǎng)處理3d、5d時，通過EdU標(biāo)記法及Western Blot分別測定細(xì)胞的增殖活力及周期相關(guān)蛋白CDK6與CYCLINA的表達(dá)水平。
　　3.設(shè)置預(yù)先共培養(yǎng)（問接共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)）組與持續(xù)共培養(yǎng)（間接共培養(yǎng)的同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo)）組及各自的對照組，通過QRT-RCR和Western B

6、lot技術(shù)分別測定成骨相關(guān)mRNA(ColⅠ，RUNX2，OCN)的表達(dá)水平及成骨相關(guān)蛋白(ColⅠ，RUNX2，OPN)的表達(dá)水平。
　　4.通過Western Blot檢測間接共培養(yǎng)后hDPSCs內(nèi)Akt/mTOR通路核心元件表達(dá)情況。
　　實驗結(jié)果
　　1.成功分離培養(yǎng)原代hDPSCs與hUCMSCs; hDPSCs與hUCMSCs皆具有問充質(zhì)干細(xì)胞特異表面標(biāo)記并可以成骨、成脂分化;成功進(jìn)行hDPSCs與hUCM

7、SCs的傳代培養(yǎng)與凍存、復(fù)蘇。
　　2.同對照組相比，間接共培養(yǎng)3d及5d后的hDPSCs內(nèi)EdU標(biāo)記陽性率提高、CDK6和CYCLIN A蛋白表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;間接共培養(yǎng)3d及5d時的hUCMSCs內(nèi)EdU標(biāo)記陽性率、CDK6和CYCLIN A蛋白表達(dá)水平與對照組無顯著性差異。
　　3.與對照組相比，間接共培養(yǎng)同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hDPSCs內(nèi)的ColⅠ、RUNX2、OCN的mRNA表達(dá)量及ColⅠ、RUNX2

8、、OPN的蛋白表達(dá)量呈不同程度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;預(yù)先共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hDPSCs內(nèi)的ColⅠ、RUNX2、OCN的mRNA表達(dá)量及ColⅠ、RUNX2、OPN的蛋白表達(dá)量呈不同程度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，間接共培養(yǎng)同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo)及預(yù)先共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hUCMSCs內(nèi)上述指標(biāo)無顯著性改變。
　　4.與非共培養(yǎng)組相比，間接共培養(yǎng)后hDPSCs內(nèi)Akt、mTOR磷酸化程度增強(qiáng)。
　　實驗結(jié)論與意義

9、
　　在hDPSCs-hUCMSCs體外間接共培養(yǎng)體系中，hUCMSCs的旁分泌作用可促進(jìn)hDPSCs的增殖及成骨分化，而hDPSCs的旁分泌對hUCMSCs的增殖與成骨分化能力未見明顯影響;間接共培養(yǎng)體系中旁分泌影響hDPSCs特性的機(jī)制可能與Akt/mTOR信號通路有關(guān)。此研究結(jié)果表明，間接共培養(yǎng)體系中hUCMSCs的旁分泌對hDPSCs增殖與成骨有正向促進(jìn)效果，這為優(yōu)化hDPSCs與hUCMSCs在組織再生研究中的應(yīng)用提供了