Bcl10基因Knockdown對(duì)HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、【背景和目的】：惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及一系列復(fù)雜的分子過程。在癌變過程中,伴隨有多種致癌基因的活化或突變以及抑癌基因的失活。Bcl10基因是一種從MALT淋巴瘤t(1;14)(p22;q32)染色體易位斷裂點(diǎn)克隆出的與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)的基因,由其編碼的Bcl10蛋白廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。Bcl10基因的突變或過表達(dá)與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。在多種實(shí)體瘤如卵巢癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、宮頸癌、乳癌、腎透明細(xì)胞癌

2、中研究發(fā)現(xiàn),Bcl10廣泛參與癌細(xì)胞的侵襲浸潤(rùn),促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[3-8]。研究表明,結(jié)直腸癌組織中Bcl10表達(dá)顯著高于正常組織[9],那么Bcl10的高表達(dá)是否也參與結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為呢?本文擬通過慢病毒介導(dǎo)的Bcl10基因knockdown后對(duì)這一問題進(jìn)行研究,并探討可能的分子機(jī)制。
　　【方法】：利用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法包裝含Bcl10基因shRNA的慢病毒顆粒,并用其感染HCT116細(xì)胞,puromycin選擇性篩選,構(gòu)建

3、Bcl10基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株模型。利用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)Bcl10mRNA和蛋白表達(dá)水平,臺(tái)盼藍(lán)拒染法和噻唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期改變,體外遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell小室)和劃痕實(shí)驗(yàn)分析Bcl10基因knockdown后對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響,Western Blot和EMSA技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的改變,探討其可能的分子機(jī)制。<

4、br>　　【結(jié)果】：將攜帶Bcl10shRNA的慢病毒顆粒感染HCT116,經(jīng)puromycin篩選成功構(gòu)建陰性對(duì)照組細(xì)胞HCT116/sh-eGFP、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCT116/shBcl10。經(jīng)RT-PCR和WesternBlot鑒定后,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Bcl10在基因和蛋白水平都被有效抑制。將該細(xì)胞模型用于后續(xù)研究,結(jié)果:(1)臺(tái)盼藍(lán)拒染法和噻唑藍(lán)法(MTT)都表明,HCT116/shBcl10的生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.05)。在克隆形成

5、實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)HCT116/shBcl10克隆形成能力下降(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期顯示,HCT116/shBcl10組細(xì)胞被阻滯在G2/M期。體外遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí),空白組HCT116和陰性對(duì)照組HCT116/sh-eGFP穿膜細(xì)胞數(shù)沒有明顯差異(P>0.05),但HCT116/shBcl10穿膜細(xì)胞數(shù)與空白組和陰性對(duì)照組相比,差異有顯著性意義(P<0.05),說明Bcl10基因knockdown后使HCT116細(xì)胞的遷移能力顯著

6、降低。(2)應(yīng)用WB和EMSA技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl10基因knockdown后,Pin1、MMP-7、MMP-9、Cdc25c、Cdc2P34、cyclinB1等分子的表達(dá)受到抑制,p-Cdc2P34(Thr14/Tyr15)的表達(dá)上調(diào),而NF-κB和JNK分子未發(fā)生改變。
　　【結(jié)論】：應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了Bcl10基因knockdown的細(xì)胞株HCT116/shBcl10。Bcl10