抑制Pin1基因?qū)Υ竽c癌HCT116細胞端粒酶活性的影響.pdf

1、研究背景：
　　大腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，致死率較高，約占所有癌癥死亡人數(shù)的8％，是目前繼肺癌、胃癌及肝癌之后第四大最常見的癌癥死亡原因。近年來，大腸癌的發(fā)病率有上升的趨勢。因此大腸癌的分子機制仍有待進一步闡明，其中細胞惡性增殖是導致大腸癌發(fā)生發(fā)展的一個重要原因。
　　PIN1（peptidy-脯氨酰順/反異構(gòu)酶PPIase）是一個高度保守的、特定的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶的家庭成員，它在包括大腸癌在內(nèi)的不同類型的惡性

2、腫瘤過度表達。Pin1蛋白中含有一個的N端的WW結(jié)構(gòu)域和一個C端的異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域。WW結(jié)構(gòu)域與p-Ser/Thr-Pro基序特異性結(jié)合，使之發(fā)生順反異構(gòu)，從而改變目的蛋白的空間構(gòu)型，進一步改變目的蛋白功能，調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用。Pin1蛋白可參與多種控制細胞生長和轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導通路，包括P53，E2F，NF-κB，CyclinD1，Cdc25C蛋白，β-catenin，AP-1，NFAT，NIMA和Wee-1。目前，Pin1蛋白已

3、作為抗癌劑的藥物靶標之一。而我們先前的研究已成功構(gòu)建質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1,它具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可有效下調(diào)Pin1基因的表達。最近研究表明，抑制Pin1導致人類細胞中端粒逐步缺失。
　　端粒作為染色體的末端，由人類染色體的末端重復序列d(TTAGGG)n和相關(guān)蛋白構(gòu)成。端粒可以保持染色體穩(wěn)定性，但會隨著細胞分裂逐漸縮短。而端粒酶則可添加端粒重復序列到3'末端端粒區(qū)，以維持端粒長度，保持基因組穩(wěn)定性。在大部分正常人體細胞和

4、組織中，端粒酶沒有活性，但在大多數(shù)腫瘤細胞，包括直結(jié)腸癌組織中，該酶是有活性的。該酶的核心組成蛋白催化亞基——端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)，由人TERT基因(hTERT)編碼，而hTERT的轉(zhuǎn)錄很大程度上取決于其啟動子活性。研究表明，多種調(diào)節(jié)蛋白可與hTERT基因啟動子區(qū)域結(jié)合，如c-myc，SP1，P53，E2F和NF-κB/p65。近期報道表明，抑制端粒酶的表達，抑制端粒酶活性可能成為一個新的腫瘤基因治療的目標。
　　目的：

5、r>　　研究在人類大腸癌HCT116細胞中，抑制Pin1基因?qū)Χ肆Ｃ富钚缘挠绊懠捌渥饔脵C制。
　　方法：
　　1.擴增Pin1基因干擾表達載體pGenesil-1-Pin1（縮寫P-shRNA）和對照載體pGenesil-1-CON(簡寫p-CON)，雙酶切載體后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序鑒定載體。
　　2.利用脂質(zhì)體將質(zhì)粒p-shRNA及其對照組p-CON轉(zhuǎn)入大腸癌HCT116細胞，通過觀察轉(zhuǎn)染48h后HCT

6、116細胞綠色熒光蛋白表達量，計算轉(zhuǎn)染效率。
　　3.提取各組HCT116細胞總RNA，利用qRT-PCR檢測Pin1在各組大腸癌HCT116細胞RNA表達情況；提取各組細胞總蛋白，利用Westernblotting檢測其Pin1蛋白表達水平的情況。
　　4.采用流式細胞檢測HCT116細胞轉(zhuǎn)染p-shRNA質(zhì)粒及p-CON質(zhì)粒后的凋亡率。
　　5.提取各組細胞端粒酶，利用TRAP-銀染法分析端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在各組人類大

7、腸癌HCT116細胞的活性水平。利用qRT-PCR檢測hTERT在各種大腸癌HCT116細胞的RNA表達情況。
　　6.利用免疫熒光與Westernblotting檢測p-NF-κB/P65在各組HCT116細胞中的定位及聚集情況。利用DNA電泳遷移率變動分析(EMSA)檢測在各組HCT116細胞中NF-κB/P65與hTER的結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)鑒定確認成功提取Pin1基因的RNA干擾表達載體。

8、　　2.利用脂質(zhì)體介導質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1轉(zhuǎn)染HCT116細胞后，觀察綠色熒光蛋白，計算其轉(zhuǎn)染效率達61%。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，Pin1的表達明顯下調(diào)(0.392±0.072-fold(P=0.001))，Pin1表達抑制率達61.8%。Westernblotting檢測也支持該結(jié)果。
　　4.流式細胞檢測結(jié)果顯示：下調(diào)Pin的表達可使細胞凋亡率上調(diào)(16

9、.40％±1.54％(P<0.05))。
　　5.TRAP-銀染法結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，端粒酶活性顯著下調(diào)(0.384±0.015(P<0.05))，其表達抑制率達60.28%。qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，hTERT轉(zhuǎn)錄表達顯著減少(0.171±0.060-fold(P=0.001))，其表達抑制率達61.8%。
　　6.免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示p-NF-

10、κB/p65主要聚集于細胞核且其聚集量隨Pin1下調(diào)而下調(diào)。電泳遷移率變動分析(EMSA)，證明NF-κB/P65蛋白能與hTERT啟動子結(jié)合，其結(jié)合力隨Pin1下調(diào)而下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)實驗證實，成功提取Pin1基因的RNA干擾表達載體，使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸癌HCT116細胞可抑制Pin1基因的表達。
　　2.經(jīng)實驗證實，下調(diào)Pin1基因表達可以有效促進人大腸癌HCT116細胞凋亡；同時可以抑制該細胞中端粒酶