2型糖尿病相關(guān)三基因過表達小鼠模型研究.pdf

1、2型糖尿病是內(nèi)分泌代謝紊亂導致的以高血糖為主要特征的慢性疾病。在前臨床研究中動物模型應用很普遍，可以模仿和再現(xiàn)2型糖尿病病理進程，可為藥物靶點篩選、新藥開發(fā)、高效治療方式的發(fā)現(xiàn)提供試驗對象。本研究構(gòu)建能在肝臟過表達11β-HSD1并在胰腺過表達CHOP和hIAPP的三基因整合過表達載體。采用顯微注射制備了轉(zhuǎn)三基因F0代、F1代小鼠，后期利用高脂高糖飲食誘導出了具有2型糖尿病相關(guān)表型的轉(zhuǎn)基因陽性C57BL/6小鼠成模。并結(jié)合個體生理生化指

2、標、組織學病理圖譜、基因表達調(diào)控相關(guān)分子生物學試驗等評價分析了此轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型。
　　1)轉(zhuǎn)多基因小鼠制備及鑒定。構(gòu)建了三基因載體，制備并繁育了轉(zhuǎn)多基因小鼠F0、F1，并對其進行陽性鑒定，選取7周齡和33周齡陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，熒光定量PCR檢測器官特異性表達。結(jié)果表明，PCR三條帶同時陽性時小鼠鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性;與陰性對照相比，陽性小鼠組織過表達情況理想（幾倍甚至上百倍）。
　　2)轉(zhuǎn)基因小鼠中外源基因拷貝數(shù)分析。熒光定量

3、試驗得出了轉(zhuǎn)基因小鼠中三個家系個體三基因拷貝數(shù)值。F1代只有6號家系與11號家系11β-HSD1基因拷貝數(shù)沒有顯著差異(P=0.49＞0.05)，其余兩兩比較結(jié)果差異均顯著(P＜0.05)。全部陽性平均值為20.33±3.72(11β-HSD1)、7.13±1.41(CHOP)、3.76±1.10(hIAPP)，反映了在小鼠上整合能力11β-HSD1＞CHOP＞hIAPP，F(xiàn)0代11號基因拷貝數(shù)為13.15(11β-HSD1)、3.51

4、(CHOP)、0.70（hIAPP），11號家系F1代依次為27.29±3.1(11β-HSD1)、5.42±0.73(CHOP)、1.61±0.26(hIAPP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個基因拷貝數(shù)不一致，大小趨勢不同小鼠個體間保持一致，代間保持一致拷貝數(shù)，但F1代有大于F0代現(xiàn)象。
　　3)高脂高糖誘導轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析。對轉(zhuǎn)基因與野生對照小鼠進行了高脂高糖誘導試驗（雌雄各四個處理，Tg HF-HG，Ng HF-HG，Tg Contro

5、l，Ng Control），誘導期間進行了表型數(shù)據(jù)監(jiān)測，定期進行糖耐量試驗與胰島素耐受試驗。結(jié)果表明:隨著誘導試驗的逐步進行高脂高糖轉(zhuǎn)基因雄性組增重顯著(p＜0.01)，飲水量組間差異不明顯(p＞0.05);空腹血糖高脂高糖轉(zhuǎn)基因雄性組略高于其他組，但呈波動狀(190天，p＜0.05);高脂高糖轉(zhuǎn)基因雄性組糖耐量減低，與野生對照組相比，胰島素抵抗提前，從誘導2月就發(fā)生胰島素抵抗。繼續(xù)誘導表型加重（120天p＜0.01）。
　　4)

6、小鼠模型病理及分子生化分析。高脂高糖誘導處理組，心臟、脂肪等器官增重均大于對照料組(Tg＞Nc∶p＜0.05);高脂高糖誘導處理，血清學結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因雄性組葡萄糖比對照組高，C肽含量降低說明胰島素分泌功能受損，還產(chǎn)生了高胰島素血癥、高酯血癥。HE切片展示了胰島的變化，高脂高糖轉(zhuǎn)基因組有的因為胰島素分泌代償而面積增大，少部分胰島已經(jīng)凋亡聚縮，高脂高糖野生對照組胰島則大部分是代償增大;免疫組化試驗，胰島大小與胰島素分泌情況與HE切片一致，h

7、IAPP聚積和細胞凋亡情況測定分析，轉(zhuǎn)基因高脂高糖組胰島hIAPP聚積遍布胰島，凋亡因子Caspase3表達增加。
　　通過2A介導的多順反子載體制備肝臟11β-HSD1過表達，胰腺CHOP基因和hIAPP基因的過表達小鼠，加上高糖高脂飼料誘導作用，引起胰島素抵抗，胰島代償增加，產(chǎn)生明顯糖耐受低減，引起小鼠胰島β細胞啟動凋亡，導致胰島素分泌不足，本試驗大部分轉(zhuǎn)基因小鼠達到了具有向心肥胖、高胰島素血癥、糖耐量減低、胰島素抵抗、胰島代