microRNA-375對(duì)2型糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控作用研究.pdf

1、[目的]：
　　本研究通過(guò)利用miR-375過(guò)表達(dá)（miRNA mimics）和特異性抑制載體(miRNA inhibitor)轉(zhuǎn)染到選取的胰島β細(xì)胞MIN6細(xì)胞系，觀察miR-375表達(dá)變化引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)和下游靶基因的表達(dá)改變，探討miR-375對(duì)其下游靶基因的影響，為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供線索，并為其早期干預(yù)提供理論依據(jù)。
　　[方法]：
　　1.結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和大量文獻(xiàn)分析miR-375的基本信息、生物學(xué)功能及其

2、在T2DM中的表達(dá)情況，并篩選出其調(diào)控的參與T2DM的發(fā)生發(fā)展的靶基因。
　　2.選取胰島β細(xì)胞MIN6細(xì)胞系，分別用含11.1 mmol/L(正常組)、25mmol/L（高糖組）葡萄糖濃度的培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行MIN6細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后用光學(xué)顯微鏡觀察胰島MIN6細(xì)胞的形態(tài)。構(gòu)建miR-375基因的過(guò)表達(dá)載體（miRNA mimics）和特異性抑制載體(miRNA inhibitor)，使用lipo3000按以下分組:空白

3、對(duì)照、陰性對(duì)照、Mimics-Negative Control、miR-375 mimics、Inhibitor-Negative Control和miR-375 inhibitor轉(zhuǎn)染到不同糖濃度培養(yǎng)后的MIN6細(xì)胞中。
　　3.結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的miR-375在2型糖尿病中的表達(dá)和本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞系樣品驗(yàn)證，分析miR-375在細(xì)胞中的表達(dá)情況。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染改變MIN6細(xì)胞系中miR-375的表達(dá)，通過(guò)Real-time PCR測(cè)定經(jīng)

4、過(guò)不同方式處理的細(xì)胞中的miR-375和各基因的表達(dá)水平，驗(yàn)證miR-375在2型糖尿病中調(diào)控的靶基因，證實(shí)相關(guān)靶基因參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。
　　[結(jié)果]：
　　1.通過(guò)生物學(xué)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步推測(cè)Pdk1、Traf6、Vegfb、Prkaa1、Adipor2、Acsl3、Insr、Jak2、Slc2a4、NFKB2及Pik3ca,11個(gè)與T2DM發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶基因可能受到miR-375的下游調(diào)控。
　

5、　2.使用特異性miR-375過(guò)表達(dá)和抑制物載體轉(zhuǎn)染到不同葡萄糖濃度組的胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-375在正常糖濃度過(guò)表達(dá)組、高糖過(guò)表達(dá)組中表達(dá)量均升高（P＜0.05），并且正常糖濃度過(guò)表達(dá)組miR-375的表達(dá)高于高糖過(guò)表達(dá)組(P＜0.05);在正常糖濃度抑制組、高糖抑制組中miR-375的表達(dá)無(wú)明顯差別。這些結(jié)果顯示本課題研究中過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功。
　　3.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，挑選

6、出的11個(gè)基因中，11個(gè)基因均有表達(dá)。其中與正常糖濃度陰性對(duì)照組相比，正常糖濃度過(guò)表達(dá)組中Pdk1、Slc2a4、Traf6、Vegfb、Prkaa1、Adipor2、Acsl3、Insr、Jak2、NFKB2、和Pik3ca的表達(dá)量降低(P＜0.05);高糖過(guò)表達(dá)組中Pdk1、Prkaa1、Adipor2、Insr、Jak2、Nfkb2、和Pik3ca的表達(dá)量也降低(P＜0.05);并且正常糖濃度過(guò)表達(dá)組中的Pdk1、Prkaa1、A

7、dipor2、Insr、Jak2、Nfkb2、和Pik3ca的表達(dá)水平低于高糖過(guò)表達(dá)組（P＜0.05）。
　　[結(jié)論]：
　　1.miR-375在高糖過(guò)表達(dá)組、正常糖濃度過(guò)表達(dá)組MIN6細(xì)胞系中的表達(dá)均有差異，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同糖濃度的miR-375過(guò)表達(dá)體的MIN6細(xì)胞模型構(gòu)建成功，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型。
　　2.miR-375在高糖胰島β細(xì)胞MIN6細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)。其可能通過(guò)參與多種與T2DM