人參、三七組方促血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及相關(guān)臨床文獻(xiàn)評(píng)價(jià).pdf

1、血管生成在缺血性疾病發(fā)病機(jī)制和治療中作用的研究已成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)課題。益氣活血中藥防治冠心病療效肯定,其改善心肌缺血與促進(jìn)缺血心肌血管生成的相關(guān)性,已為大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí),提示促血管生成可能是益氣活血藥治療冠心病的重要機(jī)制之一。本研究通過(guò)探討益氣活血藥促血管生成作用的分子機(jī)制,揭示其干預(yù)血管生成的作用環(huán)節(jié)和分子靶標(biāo),闡明益氣活血藥?kù)铕錾碌目茖W(xué)內(nèi)涵,旨在為中醫(yī)藥防治缺血性疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本論文分為三部分

2、:文獻(xiàn)綜述、臨床文獻(xiàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)和基礎(chǔ)研究。
　　 文獻(xiàn)綜述部分,分別從中醫(yī)藥治療性血管生成的研究進(jìn)展以及血管生成在冠心病防治中的研究進(jìn)展兩個(gè)方面進(jìn)行了綜述。
　　 臨床文獻(xiàn)評(píng)價(jià)部分,對(duì)1994年～2007年在科技期刊上公開(kāi)發(fā)表的益氣活血中藥治療不穩(wěn)定心絞痛的臨床文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。
　　 目的:對(duì)益氣活血中藥治療不穩(wěn)定心絞痛臨床研究進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。方法:①以[(中文標(biāo)題:不穩(wěn)定心絞痛)AND(全部檢索條目:中醫(yī)or中藥

3、or中西醫(yī)結(jié)合)AND(全部檢索條目:益氣and活血)]的檢索式檢索中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)光盤(pán)數(shù)據(jù)庫(kù),年限為1994年1月至2007年12月。②由2位研究者按照文獻(xiàn)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選,意見(jiàn)不同者通過(guò)討論解決。③獲取文獻(xiàn)的相關(guān)研究特征資料,并加以評(píng)價(jià)。④對(duì)合格的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn),進(jìn)行定量的Meta分析。結(jié)果:①共檢索到15個(gè)文獻(xiàn)。②經(jīng)兩次篩選,剔除不符合要求以及重復(fù)報(bào)道的文獻(xiàn),最終共有6篇文獻(xiàn)入選評(píng)價(jià)。③對(duì)6篇文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析程序,

4、總病例數(shù)僅385例,研究的質(zhì)量普遍不高。Meta分析顯示,加用益氣活血中藥進(jìn)行干預(yù)對(duì)不穩(wěn)定心絞痛患者心絞痛癥狀的改善、心電圖的改善、血脂的改善較單純西醫(yī)基礎(chǔ)治療顯著提高。結(jié)論:益氣活血中藥干預(yù)不穩(wěn)定心絞痛在改善心絞痛的癥狀、心電圖表現(xiàn)以及改善血脂方面有一定的療效。但由于納入研究的病例數(shù)較少和質(zhì)量不高,還有待進(jìn)一步研究。
　　 基礎(chǔ)研究部分,包括以下八個(gè)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 實(shí)驗(yàn)一 HUVEC生長(zhǎng)曲線測(cè)定
　　 目的:

5、明確不同細(xì)胞濃度、不同時(shí)間點(diǎn)HUVEC的生長(zhǎng)情況,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用合適的細(xì)胞濃度及最佳的給藥時(shí)間做準(zhǔn)備。
　　 方法:將6個(gè)濃度的細(xì)胞接種于96孔板中,每隔24h比色測(cè)定,連續(xù)5天,重復(fù)一次。
　　 結(jié)果:接種細(xì)胞后第2天,各細(xì)胞密度的生長(zhǎng)均進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。第3、4天,4×104個(gè)/ml,6×104個(gè)/ml,8×104個(gè)/ml3個(gè)濃度的細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期；第5天,1×104個(gè)/ml,2×104個(gè)/ml,3×104個(gè)/ml這3個(gè)

6、濃度的細(xì)胞還繼續(xù)增殖,而4×104個(gè)/ml的細(xì)胞已到飽和的密度；6×104個(gè)/ml,8×104個(gè)/ml兩個(gè)濃度的細(xì)胞第2天后逐漸進(jìn)入飽和狀態(tài)。
　　 結(jié)論:選用2×104個(gè)/ml～3×104個(gè)/ml這個(gè)區(qū)間的細(xì)胞數(shù)接種:細(xì)胞接種36h后給藥作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)二人參、三七不同配比和時(shí)間點(diǎn)對(duì)HUVEC增殖的影響
　　 目的:探討人參、三七組方促HUVEC增殖的最佳劑量、兩藥比例和最佳作用時(shí)間。
　

7、　 方法:將人參和三七分別按照1:1,2:1,1:2三種配比制備成0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml15個(gè)不同濃度的給藥組和1個(gè)空白組,分別在給藥24 h和48 h后比色測(cè)定。
　　 結(jié)果:三種配比的不同濃度作用于HUVEC24 h后,只有人參、三七之比為2:1時(shí),出現(xiàn)一定的量效關(guān)系,且4 mg/ml對(duì)細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng),增值率達(dá)37.3％；作用于HUVEC48 h后,三個(gè)配比均出現(xiàn)

8、一定的量效關(guān)系,人參:三七=1:1,濃度4mg/ml促細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng),增值率達(dá)26.12％。
　　 結(jié)論:人參、三七為2:1,濃度4mg/ml,藥物作用時(shí)間為24h時(shí),促HUVEC增殖作用最明顯。
　　 實(shí)驗(yàn)三人參、三七組方促HUVEC增殖及分泌VEGF的研究
　　 目的:探討人參、三七組方對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及分泌VEGF的影響。
　　 方法:細(xì)胞分為對(duì)照組、bFGF陽(yáng)性對(duì)照組、人參三七大劑量組、人

9、參三七中劑量、人參三七小劑量組,給藥24 h比色測(cè)定。用雙抗體夾心ELISA法,檢測(cè)上清中VEGF的含量。
　　 結(jié)果:人參、三七組方能夠促進(jìn)HUVEC增殖和分泌VEGF,其作用和bFGF相當(dāng),與空白組有顯著性差異。
　　 結(jié)論:人參、三七組方能夠促進(jìn)HUVEC增殖和分泌VEGF.
　　 實(shí)驗(yàn)四人參、三七組方對(duì)HUVEC VEGFR-2表達(dá)的影響
　　 目的:探討人參、三七組方對(duì)HUVEC VEGFR-2

10、表達(dá)的影響。
　　 方法:采用免疫組織化學(xué)的方法,觀察人參、三七組方干預(yù)后,HUVECVEGFR-2的表達(dá)。
　　 結(jié)果:人參、三七組方大劑量組促進(jìn)了HUVEC VEGFR-2的表達(dá)。其作用和bFGF相當(dāng),和空白組相比有明顯增加,且組間差異顯著。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可能通過(guò)促進(jìn)VEGFR-2的表達(dá)而促進(jìn)HUVEC的增殖。
　　 實(shí)驗(yàn)五人參、三七組方對(duì)血管生成信號(hào)蛋白及其mRNA的影響
　　

11、 目的:探討人參、三七組方對(duì)HUVEC的血管生成信號(hào)蛋白及mRNA的影響
　　 方法:人參、三七組方干預(yù)后,運(yùn)用Western-blotting檢測(cè)方法,分析該組方對(duì)HUVEC的VEGFR-2、Ras、MAPK表達(dá)的影響；運(yùn)用realtime-PCR對(duì)以上三種蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:人參、三七組方可不同程度的促進(jìn)血管生成信號(hào)蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK的表達(dá),但是這三種蛋白的mRNA表達(dá)卻有不同

12、程度的降低。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可促進(jìn)血管生成信號(hào)蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK的表達(dá),這可能是中藥促進(jìn)內(nèi)皮增殖,產(chǎn)生促血管生成的基礎(chǔ)。這三種蛋白mRNA表達(dá)的下降可能與其擴(kuò)增時(shí)間相關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)六 SU5416對(duì)下游信號(hào)蛋白的影響以及中藥的干預(yù)作用
　　 目的:探討中藥在血管生成信號(hào)通路上的作用靶點(diǎn)。
　　 方法:用IC50的SU5416對(duì)HUVEC VEGFR-2進(jìn)行阻斷,運(yùn)用West

13、ern-blotting檢測(cè)方法,觀察人參、三七組方對(duì)下游信號(hào)蛋白R(shí)as、MAPK表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:IC50的SU5416對(duì)HUVEC VEGFR-2阻斷后,人參、三七組方干預(yù)后,可以增加下游信號(hào)蛋白R(shí)as、MAPK的表達(dá)。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可直接作用在血管生成信號(hào)通路上Ras蛋白上,促進(jìn)其表達(dá),但還不能說(shuō)明中藥可直接作用在MAPK這一上。
　　 實(shí)驗(yàn)七 FPP對(duì)下游信號(hào)蛋白MAPK的影響以及中

14、藥的干預(yù)作用
　　 目的:探討人參、三七組方在血管生成信號(hào)通路上的作用靶點(diǎn)。
　　 方法:用IC50的FPP對(duì)HUVEC Ras進(jìn)行阻斷,運(yùn)用Western-blotting檢測(cè)方法,觀察人參、三七組方對(duì)下游信號(hào)蛋白MAPK的表達(dá)。
　　 結(jié)果:IC50的FPP對(duì)HUVEC Ras阻斷后,人參、三七組方干預(yù)后可以增加下游信號(hào)蛋白MAPK的表達(dá)。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可直接作用在血管生成信號(hào)通路上的M

15、APK蛋白上。
　　 實(shí)驗(yàn)八三維培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的研究
　　 目的:比較二維與三維細(xì)胞培養(yǎng)模型之間的差異,模擬血管生成的真實(shí)環(huán)境。
　　 方法:分別采用24孔培養(yǎng)板和Transwell小室進(jìn)行二維和三維細(xì)胞培養(yǎng),通過(guò)倒置相差顯微鏡比較二維與三維細(xì)胞培養(yǎng)之間的差異,并利用激光共聚焦顯微鏡觀察HUVEC在膠原中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
　　 結(jié)果:在二維細(xì)胞培養(yǎng)中,HUVEC出現(xiàn)經(jīng)典的鋪路石樣改變；

16、在三維細(xì)胞培養(yǎng)中,出現(xiàn)從零星的不完整的網(wǎng)狀逐漸演變成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:利用Transwell小室成功構(gòu)建HUVEC的三維培養(yǎng)體系,真實(shí)地模擬了在體血管新生的過(guò)程,從而可以更加準(zhǔn)確和真實(shí)地評(píng)價(jià)血管生成作用。
　　 小結(jié)
　　 利用Transwell小室成功構(gòu)建HUVEC的三維培養(yǎng)體系。
　　 人參三七組方可以促進(jìn)HUVEC增殖,并可促進(jìn)HUVEC分泌VEGF。
　　 人參三七組方可以直接作用