基于蛋白質(zhì)組學(xué)的血管細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò).pdf

1、血管重建(remodeling)是很多心腦血管疾病，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等的共同發(fā)病基礎(chǔ)以及其病理的基本過(guò)程。研究表明，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的血管重建在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。探索機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)動(dòng)脈血管重建的分子機(jī)制，尋找生理和病理過(guò)程中關(guān)鍵的標(biāo)記分子和潛在的藥物靶標(biāo)，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的病理研究及臨床治療具有非常重要的意義。
　　本研究首先在低切應(yīng)力(5 dyn/cm2)與正常切應(yīng)力(15 d

2、yn/cm2)條件下分別體外培養(yǎng)大鼠血管，應(yīng)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，鑒定出血管組織具有顯著性表達(dá)差異的43個(gè)蛋白質(zhì)。對(duì)這些蛋白采用基于Gene Ontology和IPA的功能與信號(hào)通路分析，預(yù)測(cè)了4個(gè)切應(yīng)力相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了Lamin A，LOX，RACK1，Rab28等新的力學(xué)敏感分子。這些分子在應(yīng)力誘導(dǎo)血管重建中的作用及其分子機(jī)制尚未見(jiàn)到研究報(bào)道。然后，我們采用平行平板流動(dòng)腔系統(tǒng)對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial

3、 cells，ECs)與平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)加載切應(yīng)力，應(yīng)用western blotting方法檢測(cè)不同水平切應(yīng)力條件下細(xì)胞內(nèi)Lamin A和LOX表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，LaminA和LOX為力學(xué)刺激敏感分子，低切應(yīng)力抑制ECs和VSMCs的Lamin A表達(dá)，而促進(jìn)LOX表達(dá)。應(yīng)用RNA干擾和重組蛋白刺激等分子生物學(xué)方法，驗(yàn)證了IPA預(yù)測(cè)的切應(yīng)力信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中與LaminA和LOX

4、相關(guān)的部分關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)表達(dá)及其調(diào)控關(guān)系。
　　由于絕大多數(shù)信號(hào)分子是通過(guò)磷酸化/去磷酸化修飾而改變其活性來(lái)發(fā)揮作用，我們又應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸活細(xì)胞培養(yǎng)(SILAC)、色譜分離磷酸化蛋白和質(zhì)譜技術(shù)，得到了周期性張應(yīng)變加載條件下，VSMCs的磷酸化蛋白質(zhì)隨時(shí)間的表達(dá)變化及相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)。基于上述數(shù)據(jù)，應(yīng)用聚類分析和功能分析等生物信息學(xué)與計(jì)算生物學(xué)方法，分析了張應(yīng)變條件下VSMCs蛋白質(zhì)磷酸化的表達(dá)模式，以及在不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的磷

5、酸化蛋白質(zhì)所參與的細(xì)胞功能和信號(hào)通路，并構(gòu)建了VSMCs在張應(yīng)變刺激下的動(dòng)態(tài)磷酸化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果除揭示了新的、可能參與應(yīng)力細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的信號(hào)途徑外，還提示，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)可能直接感受應(yīng)力刺激并調(diào)控多種結(jié)合(binding)蛋白活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞功能，為血管細(xì)胞將細(xì)胞外機(jī)械應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)信號(hào)的“應(yīng)力感受器”研究提供了新的依據(jù)。
　　為進(jìn)一步深入分析上述蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，揭示更多的、有價(jià)值的機(jī)械應(yīng)力作用下血管細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)

6、信息，尤其是直接調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子信息，我們探索了應(yīng)用大規(guī)?；蛭㈥嚵袛?shù)據(jù)推斷轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新方法，并應(yīng)用于我們的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及力學(xué)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。首先提出了平均三元互信息(AMI3)與網(wǎng)絡(luò)輔助回歸分析算法，這一從大規(guī)?；蛭㈥嚵行酒瑪?shù)據(jù)重建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新方法，并應(yīng)用大腸桿菌、酵母菌和人的B細(xì)胞微陣列數(shù)據(jù)，對(duì)該方法的準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。然后，我們構(gòu)建了人臍靜脈ECs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合低切應(yīng)力條件下ECs的基因微陣列數(shù)據(jù)

7、與血管細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用AMI3結(jié)合網(wǎng)絡(luò)輔助回歸分析，構(gòu)建了ECs響應(yīng)切應(yīng)力的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控耦合網(wǎng)絡(luò)，更全面地描述了機(jī)械應(yīng)力在血管細(xì)胞內(nèi)從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。
　　然后，我們提出網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的圖元相互作用的概念，并預(yù)測(cè)了心血管疾病相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)，疾病基因之間的圖元相互作用與普通基因之間具有明顯差異。根據(jù)這種差異用圖元相互作用構(gòu)造新的得分指數(shù)，可用來(lái)鑒定疾病基因。我們基于OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中已知疾病基因信息，

8、采用棄一法交叉檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)基于圖元相互作用的疾病基因鑒定方法與之前的隨機(jī)游走和Endeavour等方法相比，具有更高的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。最后，我們將經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的上述方法用于預(yù)測(cè)高血壓和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因，得到了NOS2與VEGFR1等12個(gè)新基因。
　　上述研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)方法，構(gòu)建機(jī)械應(yīng)力作用下血管細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了新的可能參與機(jī)械應(yīng)力感受、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子，并應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)