促血管生成素參與脈絡(luò)膜新生血管生成可能的機(jī)制.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管(CNV)疾病主要包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、病理性近視和眼底血管樣條紋等,是引起視力損失的重要病因之一,其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,受多種因素或因子調(diào)控。缺血缺氧和Bruch膜的損傷是引發(fā)多種CNV疾病的重要病理機(jī)制。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體完整性破壞導(dǎo)致血管生成因子和抑制因子的失衡,Bruch膜的破裂、脈絡(luò)膜的缺血都可活化RPE細(xì)胞合成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及各種生長(zhǎng)因

2、子,導(dǎo)致CNV的生成。
　　促血管生成素(Ang)在血管的發(fā)育成熟與穩(wěn)定、調(diào)控血管完整性方面具有重要意義。其中Ang-1和Ang-2與血管生成關(guān)系最為密切。Ang-1、Ang-2通過(guò)與Tie2受體結(jié)合后激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/蘇氨酸激酶(Akt)信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究表明Ang表達(dá)量高低與缺氧程度密切相關(guān),在CNV的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但是具體機(jī)制尚不明確。此外,已有學(xué)者證實(shí)Ang與缺氧誘導(dǎo)因子-1a(H

3、IF-1a)存在共同信號(hào)通路,提示其可能受HIF-1a轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)是一種具有優(yōu)越抗血管生成的新物質(zhì),可抑制HIF-1a表達(dá)。
　　目的：探討促血管生成素-1(Ang-1)和促血管生成素-2(Ang-2)在CNV生成和缺氧條件下RPE細(xì)胞中的表達(dá)及機(jī)制。
　　方法：(1)532nm激光誘導(dǎo)52只(104眼)雄性黑色

4、C57BL/6J小鼠CNV模型。取激光照射后7d、14d和28d做觀察點(diǎn),行熒光素眼底血管造影后在各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處死小鼠(n=2),用組織病理學(xué)觀察CNV的生長(zhǎng)情況。免疫熒光染色法檢測(cè)Ang-1、Ang-2、HIF-1a在CNV生成中的表達(dá)情況;(2)將人RPE細(xì)胞培養(yǎng)在厭氧箱中,以建立缺氧模型。按缺氧時(shí)間0h、1h、4h、12h和24h分為5組,觀察Ang-1、Ang-2與HIF-1a表達(dá)的變化;另取4h作觀察點(diǎn),按處理因素分為缺氧對(duì)照

5、組和HIF-1a抑制劑YC-1處理組,YC-1濃度分別為1μmol·L-1、10μmol·L-1和100μmol·L-1,觀察抑制HIF-1a后對(duì)Ang-1和Ang-2表達(dá)的影響。應(yīng)用免疫熒光染色法和Westernblot分別檢測(cè)Ang-1、Ang-2與HIF-1a蛋白的表達(dá)。采用單因素方差分析檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：(1)光凝后7d、14d和28d的光凝斑的百分率分別為58.3％(42/72)、62.5%(30/48

6、)和46%(11/24),組織病理學(xué)檢查顯示光凝斑內(nèi)有新生血管形成,隨著時(shí)間延長(zhǎng),視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞呈不同程度增生,可完全包繞CNV。免疫熒光結(jié)果顯示正常情況下小鼠存在Ang-1、Ang-2與HIF-1a蛋白的表達(dá),激光光凝4d時(shí),Ang-2與HIF-1a存在共表達(dá)區(qū)域,兩者均表達(dá)于光凝區(qū)、新生血管區(qū)及周圍視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜損傷區(qū);激光光凝7d時(shí)Ang-1與HIF-1a存在共表達(dá)區(qū)域,兩者均表達(dá)于光凝區(qū)、新生血管區(qū)及周圍視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜損傷區(qū)

7、。(2)在此基礎(chǔ)上,RPE細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,常氧條件下RPE細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)Ang-2蛋白表達(dá),未見(jiàn)Ang-1及HIF-1a蛋白表達(dá);缺氧條件下Ang-1和Ang-2分別與HIF-1a共表達(dá)于RPE細(xì)胞胞質(zhì)中。HIF-1a與Ang-1在缺氧早期呈上升趨勢(shì),其中HIF-1a于缺氧后4h表達(dá)最高(0.451±0.022,t=5.401,P<0.05),24h后有所下降;Ang-1于缺氧后24h表達(dá)最高(1.342±0.059,t=20.100

8、,P<0.01);Ang-2表達(dá)幾乎不變(1.542±0.129、1.621±0.131、1.574±0.146、1.624±0.027,t=0.044、0.673、0.244、0.700,均為P>0.05)。濃度為1μmol·L-1、10μmol·L-1和100μmol·L-1的YC-1均可有效抑制HIF-1a蛋白的表達(dá)(t=21.583、27.154、27.431,均為P<0.01)。HIF-1α蛋白表達(dá)下調(diào)后,Ang-1蛋白表達(dá)也

9、隨之受到抑制(t=9.492、15.487、17.942,均為P<0.05),而Ang-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(t=0.859、0.178、1.565,均為P>0.05)。
　　結(jié)論：激光可成功誘導(dǎo)小鼠CNV模型,CNV在光凝后14d達(dá)到高峰。在早期CNV生成中Ang-2與HIF-1a存在共表達(dá)區(qū)域,可能參與CNV生成,Ang-1與HIF-1a存在共表達(dá)區(qū)域,在晚期CNV生成中可能起重要作用;在此基礎(chǔ)上,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示缺氧條件下人