Smad3沉默對IGFBPrP1誘導的肝星狀細胞作用的研究.pdf

1、研究背景：各種病因可引起肝臟局部炎癥，繼而由此導致的以膠原為主的細胞外基質過度沉積，進而形成肝纖維化。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段和中心環(huán)節(jié)，屬于可逆性病變。近年來，有關肝纖維化發(fā)病機制的研究已取得了長足的進展，大量研究表明，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要細胞來源，在肝纖維化形成中起關鍵性作用[1]。
　　

2、肝纖維化是一個有多種細胞因子和多條細胞信號通路共同參與的復雜病理過程。參與肝纖維化的信號轉導通路有：Smad信號通路、JAK/STAT信號通路、NF-κB信號通路以及MAPK信號通路等[2]，其中Smad信號通路是目前研究較為清楚的信號轉導通路。有研究顯示，動物肝纖維化往往伴隨HSC數(shù)量進行性增多，Smad3 mRNA表達量顯著增高，提示Smad信號通路在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[3,4]。
　　 RNA干擾(RNA

3、 interference，RNAi)是生物界廣泛存在的保守防御反應，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉錄后基因沉默方式，它通過一些小的雙鏈RNA阻斷特定基因的表達，誘導mRNA的降解，從而達到“基因沉默”的功效。
　　 胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(insulin-like growth factor binding protein relatedprotein1，IGFBPrP1)是一種相對分子質量為31KD的可溶性分泌蛋白。

4、導師劉立新等[5,6,7]的研究發(fā)現(xiàn)IGFBPrP1可能是肝纖維化發(fā)生機制中新的致病因子。肝纖維化患者肝組織中IGFBPrP1的表達與TGFβ1及膠原的表達具有正相關關系[5]。重組IGFBPrP1可誘導HSC活化并使活化的HSC合成ECM增多[6]，而抗IGFBPrP1抗體能減少肝纖維化小鼠肝組織中ECM的沉積，且ECM與Smad3的表達變化具有正相關關系[7]。為了明確IGFBPrP1對ECM的影響是否通過Smad3信號通路來實現(xiàn)，

5、并探討IGFBPrP1對HSC中TGFβ1表達的影響，設計了本課題。
　　 第一部分 siRNA Smad3對肝星狀細胞Smad3基因表達的影響
　　 目的：探討針對大鼠Smad3基因的siRNA對肝星狀細胞Smad3基因表達的影響。
　　 方法：
　　 1.轉染細胞：采用小分子RNA干擾(RNAi)技術，將非特異帶熒光標記的siRNA(NC siRNA，與Smad3 mRNA無同源性的21nt siRN

6、A)轉染體外培養(yǎng)的HSC-T6細胞株，并在熒光顯微鏡下檢測轉染效率。
　　 2.篩選有效的siRNA：實驗分為4組：陰性對照組、2對siRNA組及空白對照組。應用實時定量PCR(RT-PCR)和Western blot法分析siRNA對HSC-T6 Smad3 mRNA及蛋白的阻抑效率。
　　 結果：
　　 1.將轉染后24h的細胞在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色熒光，說明轉染成功，轉染效率約為70％。
　　

7、 2.轉染48h后，RT-PCR及Western blot檢測結果顯示，siRNA1，siRNA2轉染組對Smad3mRNA抑制率分別為32％和41％，siRNA2轉染組Smad3蛋白表達水平抑制率為61.5％，與陰性對照組相比，差異有顯著意義(P＜0.01)，而siRNA1轉染組Smad3蛋白表達水平抑制率為7.5％，與陰性對照組相比無顯著差異。提示siRNA2對Smad3表達有較好的抑制效率，以后實驗均用siRNA2進行。
　

8、　 結論：針對Smad3的siRNA可以有效地抑制HSC-T6細胞株中Smad3 mRNA及蛋白的表達。
　　 第二部分IGFBPrP1對沉默了Smad3的肝星狀細胞分泌細胞外基質的影響
　　 目的：明確胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(IGFBPrP1)是否通過Smad3信號通路影響HSC分泌細胞外基質。
　　 方法：
　　 1.選擇體外培養(yǎng)的肝星狀細胞株(HSC-T6)作為研究對象，分別設立30μ

9、g/L IGFBPrP1處理組和空白對照組(加入等量磷酸鹽緩沖溶液(PBS))，干預因素處理48h后收集細胞培養(yǎng)上清液，應用Western blot法檢測經(jīng)IGFBPrP1刺激HSC后，上清液中CollagenⅠ和FN的表達。
　　 2.選擇體外培養(yǎng)的肝星狀細胞株(HSC-T6)作為研究對象，分別設立陰性對照組(轉染NC siRNA)、Smad3 RNAi組(轉染Smad3 siRNA2)、Smad3 RNAi+IGFBPrP1

10、組(Smad3siRNA2轉染24h后，加30μg/L IGFBPrP1作用48h)及IGFBPrP1組(培養(yǎng)液中加30μg/LIGFBPrP1作用48h)。分別提取各組細胞總蛋白并收集培養(yǎng)上清液，采用Western blot法檢測各組Smad3、CollagenⅠ和FN的表達。
　　 結果：
　　 1.Western blot結果顯示，IGFBPrP1作用于HSC后，CollagenⅠ和FN的表達均較空白對照組顯著增高

11、(0.74±0.09 vs0.53±0.07；0.63±0.07 vs0.46±0.07，P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 2.Smad3 RNAi組Smad3的表達較陰性對照組顯著降低(0.14±0.02 vs0.33±0.06，P＜0.01)。另一組實驗先對HSC-T6進行Smad3 RNA干擾，然后再加入IGFBPrP1進行刺激，CollagenⅠ和FN的表達較IGFBPrP1組明顯降低(0.42±0.05 vs

12、0.74±0.09；0.34±0.06 vs0.63±0.07，P＜0.01)。
　　 結論：IGFBPrP1可使ECM的重要組成成分CollagenⅠ和FN的分泌增加，該作用的機制之一是通過Smad3信號通路來實現(xiàn)的。
　　 第三部分 IGFBPrP1對肝星狀細胞TGFβ1表達影響的初探
　　 目的：觀察胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(IGFBPrP1)對HSC中轉化生長因子β1(transforming

13、growth factor beta1，TGFβ1)表達的影響，以判定IGFBPrP1是否可作為TGFβ1產(chǎn)生的原因之一。
　　 方法：選擇體外培養(yǎng)的肝星狀細胞株(HSC-T6)作為研究對象，分別設立IGFBPrP110μg/L、20μg/L、30μg/L處理組和空白對照組(加入等量磷酸鹽緩沖溶液(PBS))，干預因素處理24h后收集細胞爬片及培養(yǎng)上清液，采用免疫細胞化學染色觀察HSC中TGFβ1的表達變化；酶聯(lián)免疫吸附實驗(E

14、LISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1的含量。同時用Western blot法檢測經(jīng)30μg/L IGFBPrP1刺激HSC后，培養(yǎng)上清液中TGFβ1的表達。
　　 結果：免疫細胞化學染色結果顯示：各組細胞胞漿內均可見棕黃色或棕褐色顆粒沉積，TGFβ1呈陽性表達。經(jīng)圖像分析顯示，IGFBPrP110μg/L組(10.90±0.35)、20μg/L組(12.09±0.54)、30μg/L組(11.89±0.32)TGFβ1表達均

15、較空白對照組(7.71±0.63)顯著增強，且在一定范圍內呈劑量依賴關系。ELISA檢測結果顯示：TGFβ1在空白對照組已有一定量的分泌，但20μg/L組(169.59±24.87)、30μg/L組(188.34±32.24)TGFβ1的含量仍較空白對照組(136.16±19.52)增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot結果顯示：IGFBPrP1組(0.46±0.05)TGFβ1的表達較空白對照組(0.30±