IGFBPrP1對(duì)肝星狀細(xì)胞TGFβ1-Smad3及ERK1-2信號(hào)通路的影響及意義.pdf

1、研究背景：
　　 肝纖維化是各種原因引起肝損傷時(shí)發(fā)生的愈合反應(yīng)，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間階段。肝纖維化的發(fā)生是一個(gè)由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是各種因子作用的主要靶細(xì)胞。細(xì)胞因子通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于HSC，其中包括經(jīng)典的TGFβ1/Smad信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路等。近年來MAPK信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)生中的作用逐漸

2、成為熱點(diǎn)，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase，ERK1/2）信號(hào)通路是研究的最為清楚的。ERK1/2信號(hào)通路可被多種細(xì)胞因子和有絲分裂原激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)HSC的生物學(xué)活性，其中包括最強(qiáng)的致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）。
　　 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulin-like growth factor binding protein re

3、lated protein 1，IGFBPrP1)是一種由多種細(xì)胞分泌的可溶性糖蛋白，其生物學(xué)功能尚未完全明確。導(dǎo)師劉立新課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)IGFBPrP1在肝纖維化患者肝組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且與肝組織中TGFfβ1的表達(dá)呈正相關(guān)；腹腔注射IGFBPrP1可使野生型小鼠的肝組織發(fā)生肝纖維化，同時(shí)使其肝組織中TGFβ1、p-Smad2/3的表達(dá)均增加。
　　 那么，IGFBPrP1是否可激活體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞的TGFβ

4、1/Smad3信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)通路呢？目前尚未見報(bào)道。為了闡明上述問題，設(shè)計(jì)了本課題。
　　 第一部分IGFBPrP1對(duì)肝星狀細(xì)胞TGFβ/Smad3信號(hào)通路的影響
　　 目的：
　　 探討胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBPrP1)對(duì)肝星狀細(xì)胞TGFβ1/Smad3信號(hào)通路的影響。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞株（LX-2），設(shè)立空白對(duì)照組[加入等量磷酸鹽緩沖液(

5、PBS)]和IGFBPrP1處理組（加入終濃度為30μg/L的IGFBPrP1），作用24h后分別收集兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并提取全細(xì)胞蛋白。采用Westernblot法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、纖維連接蛋白(Fn)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)以及LX-2細(xì)胞中Smad3、p-Smad2/3的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.IGFBPrP1對(duì)LX-2細(xì)胞CollagenⅠ和Fn表達(dá)的影響：

6、IGFBPrP1處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CollagenⅠ和Fn的蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著增高(CollagenⅠ：0.68±0.07vs0.49±0.05，t=4.157，P＜0.05；Fn：0.54±0.07vs0.37±0.04，t=3.982，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.IGFBPrP1對(duì)LX-2細(xì)胞TGFβ1表達(dá)的影響：IGFBPrP1處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增高（035

7、±0.05vs0.21±0.04，t=3.906，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.IGFBPrP1對(duì)LX-2細(xì)胞Smad3及p-Smad2/3表達(dá)的影響：IGFBPrP1處理組細(xì)胞中Smad3的表達(dá)與空白對(duì)照組比較無明顯改變（0.65±0.05vs0.64±0.05，t=0.084，P＞0.05）；IGFBPrP1處理組細(xì)胞中p-Smad2/3的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增高(0.70±0.05vs0.46±0.03，t

8、=8.050，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IGFBPrP1處理組p-Smad2/3與Smad3的比值較空白對(duì)照組顯著增高(1.10±0.12vs0.72±0.05，t=5.181，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.IGFBPrP1可使體外培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞ECM的重要成分CollagenⅠ和Fn的分泌增加。
　　 2.IGFBPrP1可促進(jìn)體外培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞產(chǎn)生TGFβ1。

9、r>　　 3.IGFBPrP1可使體外培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞中Smad3的磷酸化增加。
　　 第二部分IGFBPrP1對(duì)肝星狀細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路的影響
　　 目的：
　　 探討胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBPrP1)對(duì)肝星狀細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路的影響。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞株(LX-2)，設(shè)立空白對(duì)照組[加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)]和IGFBPrP1處

10、理組（加入終濃度為30μg/L的IGFBPrP1），作用24h后分別提取兩組細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白。采用Westemblot法檢測LX-2細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 IGFBPrP1對(duì)LX-2細(xì)胞ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)的影響：IGFBPrP1處理組細(xì)胞中ERK1/2的表達(dá)與空白對(duì)照組比較無明顯改變（0.55±0.07vs0.54±0.05，t=0.286，P＞0.05）；I

11、GFBPrP1處理組細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增高(0.33±0.04vs0.17±0.02，t=7.538，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IGFBPrP1處理組p-ERK1/2與ERKI/2的比值較空白對(duì)照組顯著增高（0.61±0.07vs0.31±0.04，t=7.535，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 IGFBPrP1可使體外培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化增加