microRNA-200a抑制TGF-β1誘導肝星狀細胞增殖作用的機制研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)通常是由體內外多種刺激因素,如酒精、肝毒物、酶催化劑及過敏原性物質等共同作用于肝臟所引起的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積的病變過程。肝星狀細胞(hepatic stellates cell,HSC)的活化作為肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié),可受到多條信號通路及細胞因子的影響,如 Wnt/β-catenin通路、轉化生長因子β1(TGF-β1)介導的T

2、GF-β/Smad通路等。此外,除了受到傳統(tǒng)信號通路的影響外,近年來發(fā)現(xiàn),HSC的活化還可受到microRNA(miRNA)的調控。miRNA作為繼轉錄因子外,參與基因轉錄調控的另一類新興因子,在細胞的發(fā)育、分化、代謝及細胞信號通路轉導等一系列生命活動中均產生了重要作用。其中,miR-200a在癌癥及纖維化疾病中逐漸顯示出的多重效應引起了研究人員的普遍關注。但miR-200a是否以及如何參與 TGFβ和Wnt/β-catenin通路在

3、HSC的活化則鮮有報道。本課題通過研究miR-200a在大鼠病理性肝纖維化組織及活化的HSC中的表達變化,在分子水平上,深刻探討其對TGFβ和Wnt/β-catenin通路的影響,以揭示miR-200a介導HSC活化的新的作用機制。
　　本研究按照正常組10只、CCl4模型組15只的標準將雄性Sprague Dawley大鼠分為兩組。自實驗開始后,模型組大鼠給予1ml/kg50％CCl4植物油溶液皮下注射建立肝纖維化模型,每周2次

4、,總計12周;正常組給予同劑量油溶液皮下注射。12周造模結束后,取肝組織進行H&E及Masson膠原染色檢測,并采用免疫組化法測出α-SMA在大鼠肝組織中的表達變化。通過實時定量PCR檢測CCl4模型組大鼠肝纖維化組織及在不同濃度、時間點TGF-β1刺激的HSC中miR-200a的表達。通過脂質體LipofectamineTM2000轉染miR-200a mimics(模擬物)至肝星狀細胞內以觀察miR-200a對TGF-β1誘導的HS

5、C活化的影響,采用熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉染效率。對于體外培養(yǎng)的大鼠 HSC,轉染不同濃度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM),4-6 h后用5ng/ml TGF-β1刺激細胞24 h或48 h,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法,流式細胞術觀察 miR-200a對 TGF-β1誘導的HSC的增殖、周期、凋亡的影響。運用生物數(shù)據庫預測出miR-200a的潛在性功能靶點:轉化生長因子β2(TGF-β2)和β-鏈

6、蛋白(β-catenin)。利用雙熒光素酶報告基因技術驗證這一預測并采用PCR及Western blots等技術,分別檢測TGF-β1誘導活化的HSC中α-SMA,TGF-β2,β-catenin mRNA及蛋白水平的表達。
　　結果：發(fā)現(xiàn),在體內實驗中,與正常組相比,miR-200a在CCl4誘導的肝纖維化組織中,其表達是降低的。在體外實驗中,用不同濃度(0,5,10,15 ng/ml)的TGF-β1,以及在不同時間點(0,6,

7、24,48 h)用同一濃度的TGF-β1(5ng/ml)分別刺激 HSC,miR-200a的表達呈現(xiàn)出劑量-時間依賴性下調趨勢。與陰性對照組相比,不同濃度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM)瞬時轉染進入HSC,可以顯著降低TGF-β1誘導的α-SMA的表達水平。過表達miR-200a可以明顯抑制TGF-β1刺激的HSC的增殖及活化,但并未增加細胞的凋亡。此外,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實了TGF-β2和β-c

8、atenin是miR-200a的功能性靶點。在TGF-β1刺激活化的HSC中,miR-200a可以顯著降低TGF-β2的mRNA及蛋白水平表達,但對于其另一個靶點β-catenin,miR-200a只能降低其蛋白水平表達,對其mRNA水平則不產生影響。以上研究提示,miR-200a對TGF-β2及β-catenin二者的作用方式存在差異,miR-200a可通過影響不同靶蛋白(TGF-β2,β-catenin)的表達,參與調控TGF-β及