CPPS-BDi-1-載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體靶向治療膀胱腫瘤.pdf

1、目的：
　　 1．構(gòu)建CPPs-BDI-1-載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體進(jìn)行體內(nèi)外膀胱癌細(xì)胞的殺傷研究，為探索治療膀胱癌的方法提供實驗基礎(chǔ)。
　　 2．觀察三聯(lián)體介導(dǎo)的對EJ人膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用，探索載MMC白蛋白納米微球抑制膀胱腫瘤生長的機(jī)理。
　　 3．建立裸小鼠皮下瘤和原位膀胱癌模型，觀察單純?nèi)?lián)體瘤內(nèi)注射及膀胱灌注給藥，以及同時聯(lián)合紫杉醇白蛋白納米微球經(jīng)腹主動脈注射給藥的治療作用。
　　 方

2、法：
　　 1．MMC-NS的制備及質(zhì)量鑒定：通過交聯(lián)固化的方法制備絲裂霉素白蛋白納米微球（MMC-NS），正交實驗優(yōu)化MMC-NS的制備工藝，分別選擇油相/水相比、高速分散速度、白蛋白濃度、攪拌固化時間4個影響因素，以微球粒徑小于300nm的粒子分布百分?jǐn)?shù)、微球的載藥量(DL)、藥物包封率(DTE)3個指標(biāo)作為優(yōu)化技術(shù)的評估指標(biāo)。掃描電鏡觀察微球的形狀和分布；體外釋藥方法及釋藥特性的研究。
　　 2．TAT-EGFP融

3、合蛋白的制備及鑒定：(1).含TAT11寡核苷酸雙鏈pT7460載體的構(gòu)建；(2).pT7460-EGFP載體的構(gòu)建；(3).TAT-EGFP融合蛋白的表達(dá)和純化。
　　 3．抗體BDI-1-CPPs偶聯(lián)物的制備：(1).BDI-1單克隆抗體的制備與純化：(2).BDI-1與TAT-EGFP融合蛋白的連接。
　　 4．CPPs-BDI-1—載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體的制備及鑒定。
　　 5．CPPs—BDI-1

4、—載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體對人膀胱腫瘤細(xì)胞體外殺傷作用的機(jī)制研究。
　　 6．CPPs—BDI-1—載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體對種植裸小鼠體內(nèi)的原位膀胱癌和皮下瘤的抗腫瘤治療效果研究。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功制備了三聯(lián)體的原料：(1).研制成功載絲裂霉素白蛋白納米微球，粒徑(314.18±31.093nm)，載藥量為1.24％，包封率為63.24%，大小均勻，表面光滑，分散性好，可用于后續(xù)實驗；(2)

5、.應(yīng)用大腸桿菌成功制備并鑒定具有高活性的融合蛋白穿膜肽增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（TAT-EGFP）：(3).摸索了腹水法制備高效價BDI-1抗體的條件，并鑒定BDI-1人膀胱癌單克隆抗體濃度1.5mg/ml、效價為20000，實驗證明具有高抗體活性。
　　 2．通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測證實：成功連接具有高度特異性、穿膜活性的CPPs—BDI-1—載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體。
　　 3．體外實驗

6、證明了CPPs—BDI-1—MMC-NS三聯(lián)體對EJ人膀胱癌細(xì)胞具有高效的殺傷效果；應(yīng)用熒光探劑Fura-2/AM，通過RF-5301PC熒光分光光度計，檢測用藥后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的最大吸收峰值，證實CPPs—BDI-1—MMC-NS三聯(lián)體增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈時間相關(guān)性。其抗腫瘤作用機(jī)制之一，可能是通過內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部激發(fā)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；通過熒光定量RT-PCR檢測，白蛋白可引起白蛋白受體SPARC蛋白基

7、因過表達(dá)，CPPs-BDI-1-MMC-NS可進(jìn)一步增強(qiáng)SPARC蛋白基因過表達(dá)。
　　 4．首次發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞膜表面微絨毛與細(xì)胞穿膜肽內(nèi)化載藥白蛋白納米微球入細(xì)胞內(nèi)部相關(guān)，且微球內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞后微絨毛消失。
　　 5．創(chuàng)立一項國家發(fā)明專利（發(fā)明創(chuàng)造名稱：裸小鼠膀胱癌原位模型建立方法和裝置：發(fā)明專利號：201110325574.2）。使用本專利發(fā)明的手術(shù)器械將EJ人膀胱癌細(xì)胞種植在裸小鼠膀胱上，可更高效更科學(xué)地建立原位膀胱

8、癌模型。
　　 6．成功將髂內(nèi)動脈灌注紫杉醇白蛋白納米藥物治療方案應(yīng)用于裸小鼠，并聯(lián)合膀胱灌注CPPs-BDI-1-MMC-NS三聯(lián)偶聯(lián)物進(jìn)行體內(nèi)實驗，取得良好的治療效果?？偨Y(jié)了腹部反復(fù)切開給藥的方法，為需要反復(fù)開腹給藥的實驗提供了一手實驗資料。
　　 結(jié)論：
　　 1．自行研制的CPPs—BDI-1—載MMC白蛋白納米微球三聯(lián)體，具有高度的穿膜活性和特異性，可用于后續(xù)完成實驗。
　　 2．體外實驗證明了

9、CPPs—BDI-1—MMC-NS三聯(lián)體有促進(jìn)體外培養(yǎng)的EJ人膀胱癌細(xì)胞凋亡，具有高效的殺傷效果?；緳C(jī)制可能是：(1)．CPPs—BDI-1—MMC-NS三聯(lián)體增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈時間相關(guān)性，其抗癌作用機(jī)制之一，可能是通過內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，激發(fā)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高，以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；(2).白蛋白可引起SPARC基因過表達(dá)，CPPs-BDI-1-MMC-NS可進(jìn)一步增強(qiáng)白蛋白受體SPARC基因過表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生更多的SP

10、ARC蛋白與載藥白蛋白微球結(jié)合，可能是載藥白蛋白納米微球高效殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。
　　 3．細(xì)胞穿膜肽內(nèi)化載藥白蛋白納米微球入細(xì)胞內(nèi)，可能與細(xì)胞膜表面微絨毛的協(xié)助相關(guān)。
　　 4．自行研制的建立裸小鼠膀胱癌原位模型的國家發(fā)明專利，可將人膀胱癌細(xì)胞種植在裸小鼠膀胱上，建立更科學(xué)的原位膀胱癌模型。
　　 5．對裸小鼠原位膀胱癌灌注CPPs—BDI-1—MMC-NS三聯(lián)體聯(lián)合髂內(nèi)動脈灌注紫杉醇白蛋白載藥納米微球的治