IL6在MSCs修復(fù)缺氧缺血性腦損傷的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分 MSCs移植HIBD后海馬IL6釋放與凋亡相關(guān)基因表達(dá)
　　目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植新生大鼠缺氧缺血性腦損傷過程中白介素6與腦細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　方法：采用Rice法，大鼠生后7天造模，造模之后24小時(shí)內(nèi)，腹腔注射1~1.5×106 MSCs；將55只大鼠隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組（sham）20只，模型組（HIBD）22只，干細(xì)胞組（MSCs）10只，在造模后一月時(shí)，采用水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力；在造模后3

2、天、7天和14天分別取三組海馬組織做Realtime PCR、Western Blotting以及免疫熒光檢測(cè)IL6，Bax和Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1水迷宮測(cè)試：第1天可視化訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，三組間尋找平臺(tái)的時(shí)間和尋找平臺(tái)的距離無組間差異，可以排除造模的影響；第2-6天尋找平臺(tái)的時(shí)間和尋找平臺(tái)跑的距離顯著低于sham組，MSCs組尋找平臺(tái)的時(shí)間和尋找平臺(tái)跑的距離曲線位于sham組和HIBD組之間，提示MSCs移植對(duì) H

3、IBD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定改善；第7天時(shí)，在目標(biāo)象限穿梭平臺(tái)的次數(shù)顯示 HIBD組低于 sham組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而MSCs組穿梭平臺(tái)次數(shù)比HIBD組多但兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2分子生物學(xué)檢測(cè)：⑴ IL6 mRNA表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)三組間表達(dá)情況均不同，在造模后3d時(shí)，三組間IL6 mRNA表達(dá)無明顯差異，而在蛋白水平，HIBD組IL6較其他兩組增加；在造模后7d時(shí)，在mRNA水平和蛋白水平，MSCs組IL6較sham

4、組和HIBD組都明顯升高，而此時(shí)，HIBD組IL6與sham組相當(dāng)；在造模后14d時(shí)，三組間IL6在mRNA和蛋白水平無明顯差異；⑵Bax在3d和14d時(shí)，在mRNA水平，三組間沒有差異，只有在7d時(shí)， HIBD組Bax表達(dá)明顯高于sham組，而 MSCs組明顯低于 HIBD組；在蛋白水平，HIBD組 Bax在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都高于sham組，在3d時(shí)，MSCs組Bax與HIBD組無明顯變化，但在7d和14d時(shí)，MSCs組Bax較HIBD組明

5、顯降低；⑶在mRNA水平，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)三組間Bcl-2均無差異；在蛋白水平，在3d和14d時(shí)，MSCs組較HIBD組有一定增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在7d時(shí)， HIBD組較sham組明顯降低，而MSCs組與HIBD組沒有明顯差異。
　　3.形態(tài)學(xué)：⑴組織形態(tài)觀察，水迷宮測(cè)試后隨機(jī)取大腦灌注標(biāo)本并拍照發(fā)現(xiàn)，sham組大腦外觀沒有局灶性壞死區(qū)域，但HIBD組可見損傷側(cè)大腦有明顯的壞死區(qū)，呈現(xiàn)與周圍不同的白色區(qū)域，而 MSCs組損傷側(cè)壞死

6、區(qū)較HIBD組明顯縮??；⑵免疫熒光顯示：造模后第3、7d時(shí)，HIBD組海馬CA1和CA2-3區(qū)與sham組的IL6有少量表達(dá)，MSCs組海馬CA1、CA2-3區(qū)出現(xiàn)大量表達(dá)；3d時(shí)三組的Bax表達(dá)沒有明顯變化，7天時(shí)HIBD組較sham組明顯增高，而MSCs組較HIBD組有所降低。
　　結(jié)論： HIBD造模后海馬損傷具有時(shí)間階段性，在急性損傷第3天，是以炎癥為主損傷，受損海馬產(chǎn)生大量IL6，起到炎癥損傷作用， MSCs移植使海馬I

7、L6表達(dá)降低，可能在此時(shí)起到調(diào)節(jié)免疫和抗炎作用；而損傷后第7天，隨著時(shí)間推移，HIBD炎癥反應(yīng)逐漸平穩(wěn)， MSCs移植后海馬高表達(dá)IL6，而Bax表達(dá)降低，IL6可能通過抗腦細(xì)胞凋亡而促進(jìn)損傷腦修復(fù)。
　　第二部分過表達(dá)IL6重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：構(gòu)建攜帶特異表達(dá)大鼠白介素-6（interleukin-6，IL6）的重組腺病毒，為研究體外過表達(dá)IL6對(duì)PC12細(xì)胞凋亡作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：以大鼠骨髓

8、間充質(zhì)干細(xì)胞的mRNA為模板，經(jīng)PCR獲得目的基因IL6，將其定向克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TOX中，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒 pAdTrace-IL6，并在 BJ5183菌中與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組獲得腺病毒載體 pAd-IL6,PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞包裝成重組腺病毒。腺病毒Ad-IL6感染PC12細(xì)胞，Realtime PCR和Western Blotting檢測(cè)IL6表達(dá)。
　　結(jié)果：PCR電泳

9、及酶切鑒定證實(shí)目的基因正確克隆至腺病毒載體中，其基因序列與Genbank報(bào)道一致；Realtime PCR和Western Blotting結(jié)果均顯示，Ad-IL6腺病毒顆粒感染PC12細(xì)胞后，IL6表達(dá)水平較對(duì)照組Ad-RFP明顯增高。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了特異性表達(dá)大鼠 IL6基因的重組腺病毒載體Ad-IL6，并獲得了具有感染能力的腺病毒，感染真核細(xì)胞后可高表達(dá)IL6，為進(jìn)一步研究IL6功能及其在多種疾病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供重

10、要分子手段。
　　第三部分 IL6對(duì)缺氧缺糖損傷PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的作用
　　目的：了解IL6對(duì)缺氧缺糖損傷PC12細(xì)胞抗凋亡作用。
　　方法：利用PC12細(xì)胞，模擬海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，利用缺氧缺糖損傷（oxygen and glucose-deprivation, OGD）細(xì)胞模型模擬HIBD；從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、凋亡率和線粒體膜電位（ mitochondrial membrane potency,MMP）檢測(cè)PC12細(xì)

11、胞凋亡情況；利用腺病毒Ad-IL6感染PC12并且以空載體病毒Ad-RFP作為對(duì)照，檢測(cè)過表達(dá)IL6對(duì)凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.PC12 OGD建模：⑴形態(tài)學(xué)，在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)經(jīng)OGD處理的PC12細(xì)胞形態(tài)多樣、胞體不清晰、胞核不完整、且不易觀察到，細(xì)胞似被擠壓回縮，細(xì)胞聚集擁簇成團(tuán)狀呈菊花樣、有空隙，殘存有少許正常細(xì)胞，培養(yǎng)液中浮有壞死細(xì)胞殘?bào)w，而正常細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或者橢圓形、胞體清晰、胞核完整清晰、透亮，鏡下細(xì)胞

12、排列分布均勻，無聚集現(xiàn)象，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密均勻，無漂浮等現(xiàn)象；⑵OGD未處理組和處理組的凋亡率和MMP，未處理組的凋亡率是8.96±0.50， OGD處理組的凋亡率是45.35±3.98，兩者具有顯著性差異（P=0.0119）；未處理組的MMP是5.67±0.76，OGD處理組的MMP是37.75±4.78，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0220）。⑶ PC12細(xì)胞在 OGD處理之后， Bax表達(dá)較control組高，而Bcl-2表

13、達(dá)較control組低。
　　2.Ad-IL6和Ad-RFP感染PC12后效果鑒定：⑴兩種腺病毒在同等條件下，感染PC1236小時(shí)之后，兩種腺病毒在熒光表達(dá)量是相當(dāng)?shù)模虎屏魇綑z測(cè)兩種腺病毒感染 PC12后凋亡率和 MMP，Ad-RFP組的凋亡率是14.25±0.4864，Ad-IL6組的凋亡率是11.43±1.635，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.1737）；Ad-RFP組的MMP是18.82±3.831，Ad-IL6組的MMP是

14、20.09±1.548，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.7865)，提示兩種病毒因感染造成PC12損傷是相當(dāng)?shù)摹?br>　　3.Ad-IL6和Ad-RFP感染PC12后經(jīng)OGD處理，發(fā)現(xiàn)⑴細(xì)胞凋亡率， Ad-RFP組的凋亡率是41.89±3.997, Ad-IL6組的凋亡率是27.89±2.185，兩組間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0277）⑵細(xì)胞MMP， Ad-RFP組的MMP是43.13±3.749，Ad-IL6組的MMP是31.2

15、5±1.780，兩組間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0242）⑶Ad-IL6組的IL6在mRNA和蛋白水平均高于Ad-RFP組，Ad-IL6組Bax在mRNA和蛋白水平均低于于Ad-RFP組，但Bcl-2表達(dá)兩組間沒有差異。
　　結(jié)論：
　　1. Ad-IL6感染PC12與對(duì)照組相比較可以模擬過表達(dá)IL6的影響，并排除病毒自身生物學(xué)影響；
　　2.在OGD損傷模型中，IL6具有抗凋亡作用，這一作用可能主要是通過抑制Bax