TLR2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的: 通過(guò)體外MSCs與H2O2損傷的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，闡明MSCs通過(guò)降低凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并初步探討其中TLR2相關(guān)信號(hào)通路的作用。
　　方法: 采用不同濃度的H2O2(1.0mM，2.5mM，5.0mM)損傷PC12細(xì)胞1h，同時(shí)以未處理PC12細(xì)胞作為對(duì)照組，MSCs共培養(yǎng)采用混合培

2、養(yǎng)24h。MTS檢測(cè)共培養(yǎng)前后PC12細(xì)胞的存活能力，LDH含量測(cè)定和NO釋放實(shí)驗(yàn)分析H2O2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，Annexin-V-EGFP-PI雙染試劑盒檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡情況，鈣影像系統(tǒng)檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+變化，全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)PC12細(xì)胞的靜息膜電位，RT-PCR測(cè)定Bcl-2和caspase-3凋亡相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)變化，ELISA試劑盒檢測(cè)損傷微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子的分泌變化，Western Blotting分析TLR

3、2及其信號(hào)通路下游核因子NFκB的表達(dá)水平。
　　結(jié)果: (1)經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，PC12細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志MAP-2、NSE和Nestin，免疫熒光結(jié)果同樣顯示PC12細(xì)胞內(nèi)有MAP-2表達(dá)。(2)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)H2O2濃度為1.0mM組的細(xì)胞損傷最輕，與正常對(duì)照組相比基本無(wú)差別;但隨著H2O2濃度的增高，細(xì)胞損傷程度逐漸加重。MSCs共培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示MSCs促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)。(3) MTS分析結(jié)果顯示，2.5

4、mM和5.0mM組細(xì)胞的存活能力較正常對(duì)照組分別降低了50％和75％(P＜0.05 vs.control組)，而1.0mM組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異;MSCs共培養(yǎng)組與其他共培養(yǎng)組（條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)組和PC12細(xì)胞共培養(yǎng)組）相比，細(xì)胞的存活能力更強(qiáng)。(4)在LDH檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，三組經(jīng)不同濃度H2O2處理的細(xì)胞中LDH的分泌均有增加，與未處理組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05 vs.control組);PC12細(xì)胞損傷后的MSCs共培養(yǎng)

5、組比未損傷共培養(yǎng)組中釋放的LDH略有增加，但是與PC12單獨(dú)損傷組相比，LDH增加的幅度減少(P＜0.05 vs.control組)。(5) NO釋放測(cè)定結(jié)果同樣表明，各組H2O2不同處理中的NO含量均高于正常對(duì)照組，但僅有5.0mM組與對(duì)照組之間存在顯著性差異(P＜0.05 vs.control組)。在損傷后MSCs共培養(yǎng)組中，NO的濃度卻顯著低于未損傷共培養(yǎng)對(duì)照組，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05 vs.control組)。(6)

6、 Annexin-V-EGFP-PI的免疫熒光結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增高，紅色標(biāo)記的細(xì)胞核逐漸增多;而在MSCs共培養(yǎng)組中基本未見(jiàn)中晚期凋亡的紅色熒光，僅有EGFP標(biāo)記早期凋亡的綠色熒光出現(xiàn)，并隨著H2O2濃度的增高逐漸增多。(7)鈣影像檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性的NMDA可誘導(dǎo)未損傷的PC12細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+發(fā)生急劇性地外流，而1.0mM和2.5mM H2O2損傷組卻對(duì)NMDA的刺激沒(méi)有反應(yīng)。通過(guò)MSCs與損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)

7、后，NMDA刺激可引起2.5mM和5.0mM兩組細(xì)胞胞內(nèi)鈣緩慢降低，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但1.0mM組與對(duì)照組之間沒(méi)差別。(8)細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示MSCs共培養(yǎng)后2.5mM組較共培養(yǎng)前有更大的靜息膜電位，共培養(yǎng)體系中1.0mM組和2.5mM兩組較未損傷共培養(yǎng)組具有更大的負(fù)值膜電位(P＜0.05);而單獨(dú)損傷各組間無(wú)顯著性差異。(9) RT-PCR結(jié)果顯示，在不同濃度H2O2損傷PC12細(xì)胞的各組之間Bcl-2和c

8、aspase-3 mRNA表達(dá)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但在損傷PC12細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)組，2.5mM和5.0mM組中Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著高于未損傷共培養(yǎng)組(P＜0.05)，而1.0mM組和對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。與此相反，caspase-3 mRNA的表達(dá)水平在5.0mM-共培養(yǎng)組中呈明顯下降趨勢(shì)。(10) ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-10的分泌在單獨(dú)的PC12細(xì)胞損傷組隨著H2O2濃度的增加而逐漸增高，而在共培養(yǎng)組則逐漸

9、降低;IL-6的分泌水平在MSCs共培養(yǎng)組呈現(xiàn)整體劇增趨勢(shì);共培養(yǎng)前后損傷微環(huán)境中TNF-α、IFN-β、IL-8和NGF等因子的分泌情況在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(11)Western Blotting檢測(cè)顯示:單獨(dú)損傷組隨著H2O2濃度增高，TLR2的表達(dá)稍有增強(qiáng);MSCs共培養(yǎng)后各組TLR2表達(dá)水平則逐漸減弱。并且發(fā)現(xiàn)NFκB P65的表達(dá)趨勢(shì)與之相同。
　　結(jié)論: (1) MSCs共培養(yǎng)提高了受損傷PC12細(xì)胞的存活能力，同時(shí)

10、顯著降低了細(xì)胞凋亡和壞死，對(duì)損傷細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。(2)MSCs可上調(diào)Bcl-2、下調(diào)caspase-3，同時(shí)分泌IL-6調(diào)節(jié)IL-10的分泌，促進(jìn)PC12細(xì)胞損傷的修復(fù)。(3) MSCs改善損傷PC12細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制可能是通過(guò)TLR2→NFκB信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的分泌，在損傷局部微環(huán)境中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分 TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺氧缺血性腦損傷中的調(diào)節(jié)作用
　　目的: 明確MSCs移植通

11、過(guò)調(diào)節(jié)TLR2信號(hào)通路促進(jìn)HIBD大鼠腦損傷的修復(fù);闡明TLR2信號(hào)通路在HIBD過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法: 將180只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、HIBD造模組、MSCs移植治療HIBD組（MSCs組）及給予Pam3CSK4干預(yù)后HIBD造模組（Pam3CSK4組）。在大鼠7日齡時(shí)采用Rice法結(jié)扎并離斷實(shí)驗(yàn)大鼠的左頸總動(dòng)脈，sham組僅進(jìn)行頸部皮膚切開(kāi)后縫合，Pam3CSK4組在HIBD損傷前16h經(jīng)腹腔注射給

12、予Pam3CSK430μg/只，MSCs組則在HIBD損傷后24h以腹腔注射方式給予原代培養(yǎng)的MSCs1.5×106cells/只。Morris水迷宮檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能;Real-timePCR和Western Blotting方法檢測(cè)HIBD后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠損傷側(cè)海馬組織中TLR2的表達(dá)變化，并比較分析HIBD與Pam3CSK4兩組間TLR2及其相關(guān)信號(hào)通路因子、凋亡因子Bax的表達(dá)情況;ELISA試劑盒測(cè)定大鼠損傷側(cè)海馬

13、組織中IL-10的分泌水平。
　　結(jié)果: (1) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期顯著長(zhǎng)于sham組(P＜0.05 vs.sham組)，而經(jīng)MSCs移植治療的實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺(tái)所用時(shí)間則介于sham組和HIBD組之間，與sham組及HIBD組均有顯著性差異（P＜0.05）;在第6d的平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)中，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠停留在平臺(tái)所在象限的平均時(shí)間明顯短于sham組，MSCs組則介于兩者之間，與HIBD組及

14、sham組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(2)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著損傷時(shí)間（3d、7d和14d）的延長(zhǎng)，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠損傷側(cè)海馬組織中TLR2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。在對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)不同處理三組（正常對(duì)照組、HIBD造模組和MSCs回輸組）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HIBD組TLR2的表達(dá)水平較sham組高（P＜0.05 vs.sham組）;而MSCs組與HIBD組相比，TLR2的表達(dá)水平卻呈下降趨勢(shì)（P＜0.05 vs.HIBD組）。(3) HI

15、BD組大鼠損傷側(cè)海馬組織中IL-10分泌水平明顯高于sham組(P＜0.05)，而MSCs移植治療降低了損傷側(cè)海馬組織中IL-10的水平(P＜0.05)。(4)相較于HIBD組大鼠，TLR2特異性激動(dòng)劑Pam3CSK4顯著增加了HIBD實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，并降低了損傷大鼠在平臺(tái)所在象限停留的平均時(shí)間，同時(shí)增強(qiáng)了損傷側(cè)海馬組織中TLR2、NFκB和Bax的表達(dá)水平，并使IL-10的分泌增加。
　　結(jié)論: MSCs移植通過(guò)下調(diào)