基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的適體傳感器用于檢測(cè)藥物小分子——腺苷.pdf

1、生物傳感器是一種能將生物識(shí)別過(guò)程轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)信號(hào)的裝置，主要包括兩個(gè)重要的功能性組件:目標(biāo)物識(shí)別組件和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件。其中，目標(biāo)物識(shí)別組件是影響其傳感性能的核心元素。近年來(lái)，適體以其高親和力、高特異性以及廣泛目標(biāo)物等特點(diǎn)引起了人們?cè)絹?lái)越多的研究興趣和關(guān)注。以適體為識(shí)別元件的傳感器即適體傳感器逐漸成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)和研究重點(diǎn)。由于靈敏度高、響應(yīng)快速和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，熒光法已作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件廣泛用于各類(lèi)適體傳感器中。因此，本文的研究工作主

2、要集中于如何在現(xiàn)有生物學(xué)分析技術(shù)基礎(chǔ)上構(gòu)建新型的熒光適體傳感器。
　　腺苷是一種重要的生物藥物小分子，參與機(jī)體多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，具有重要的生理和藥理作用，如舒張血管、收縮平滑肌以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，是治療陣上性心動(dòng)過(guò)速(PSVT)的一線藥物[132-136]。此外，生物樣本中腺苷的檢測(cè)可用于疾病診斷、病程的監(jiān)測(cè)以及癌癥的早期診斷[137-139]。因此對(duì)腺苷的定量檢測(cè)，尤其是生物樣本中腺苷的檢測(cè)在臨床研究、疾病的診

3、斷和預(yù)防以及癌癥的早期診斷等方面具有重要的意義。
　　自腺苷適體被篩選出來(lái)后，基于適體傳感器的腺苷檢測(cè)法得以快速發(fā)展。然而，現(xiàn)有的腺苷適體傳感系統(tǒng)靈敏度往往不夠理想，且不能直接用于復(fù)雜生物樣本中腺苷的定量檢測(cè)。因此，進(jìn)一步提高腺苷檢測(cè)的靈敏度和實(shí)現(xiàn)生物樣本中的直接檢測(cè)是現(xiàn)在腺苷適體傳感器所面臨的重大挑戰(zhàn)。本文中我們利用恒溫、無(wú)酶的信號(hào)放大技術(shù)——發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝，構(gòu)建了新型的熒光適體傳感器，提高了腺苷的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)了生物樣本中腺

4、苷的分析檢測(cè)。
　　第一章首先對(duì)生物傳感器進(jìn)行了綜述，尤其是熒光適體傳感器的特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)及發(fā)展。其次，概述了現(xiàn)有的幾類(lèi)等溫信號(hào)放大技術(shù)，重點(diǎn)介紹了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的無(wú)酶信號(hào)放大技術(shù)。隨后，對(duì)腺苷的重要生理和藥理作用進(jìn)行了介紹。最后，就腺苷適體傳感器的發(fā)展和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了概述。
　　第二章構(gòu)建了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的新型適體傳感系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了腺苷的無(wú)酶、免標(biāo)記和雙重放大的分析檢測(cè)。通過(guò)設(shè)計(jì)將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)引物鏈部分封

5、閉在發(fā)卡H2中，將G-四分體序列分別連接在發(fā)卡H3的兩端。腺苷的加入可以觸發(fā)發(fā)卡H1和H2進(jìn)行催化自組裝反應(yīng)(CHA)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第一步放大;CHA產(chǎn)物所暴露出的HCR引物鏈可以進(jìn)一步觸發(fā)H3和H4進(jìn)行HCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第二步放大。HCR反應(yīng)后，原來(lái)分為兩段的G-四分體序列可以形成完整的G-四分體結(jié)構(gòu)，插入熒光染料NMM后實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該方法對(duì)腺苷的線性范圍為5.0×10-6molL-1-2.0×10-4molL-1，

6、檢測(cè)限為9.7×10-7molL-1。該檢測(cè)限較Yu課題組酶輔助放大的腺苷適體傳感器降低了約12倍[150]，較本課題組之前構(gòu)建的無(wú)酶、放大的腺苷適體傳感器降低了約6倍[115]。所構(gòu)建的適體傳感器能實(shí)現(xiàn)均相中腺苷的無(wú)酶、免標(biāo)記和雙重放大的定量檢測(cè)，靈敏度高、特異性好，具有在復(fù)雜生物基質(zhì)中應(yīng)用的潛能。
　　雖然我們構(gòu)建的腺苷適體傳感器的靈敏度得到了顯著提高，但是該靈敏度仍舊不夠理想，不能用于生物樣本的直接分析檢測(cè)。為此，我們開(kāi)展了

7、下一個(gè)工作。第三章構(gòu)建了基于共區(qū)域化觸發(fā)HCR的腺苷適體傳感器，可以用于生物樣本中腺苷的直接檢測(cè)。在該體系中，首先將腺苷適體截為兩半，分別連有粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域，通過(guò)腺苷的“粘合”作用使得兩個(gè)適體片段結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域的共區(qū)域化，形成完整的引物鏈，觸發(fā)HCR反應(yīng)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該方法對(duì)腺苷的線性范圍為1.0×10-6molL-1-1.2×10-4molL-1，檢測(cè)限為2.0×10-7molL-1，較Yu課題