鉤端螺旋體毒性蛋白VapC核酸酶活性及其對(duì)宿主細(xì)胞毒性作用的研究.pdf

1、目的：了解鉤端螺旋體毒素-抗毒素系統(tǒng)中毒性蛋白VapC的功能及其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用。
　　 方法：以致病性問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)vapB、vapC、vapBC基因并構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SDS-PAGE檢測(cè)目的重組蛋白rVapB和rVapC表達(dá)情況，Ni-NTA親和層析柱提純r(jià)VapB和rVapC。檢測(cè)rvapB和rVapC有無(wú)水解問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株及THP-1細(xì)胞DNA或RNA活性。分別

2、采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blot試驗(yàn)，檢測(cè)問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株感染THP-1細(xì)胞前后vapB和vapC基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的變化。采用免疫熒光激光共聚焦顯微鏡法檢測(cè)VapB和VapC蛋白在問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株感染THP-1細(xì)胞中表達(dá)情況。構(gòu)建vapB和vapC基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用CCK-8試劑檢測(cè)VapB和VapC蛋白對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果：所克隆的vapB和vapqC基因核苷酸及氨基酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全