蛋白酶體活性改變在錳誘導的PC12細胞毒性中的作用研究.pdf

1、[背景]錳是一種機體必需的微量元素，但過多的錳進入體內(nèi)則會產(chǎn)生毒性作用。錳的毒性作用主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，慢性錳中毒主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)功能障礙，類似于帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)的癥狀。盡管在具體的作用方面存在一定的差異，錳仍然被看作是PD的重要環(huán)境危險因素之一。 在真核生物細胞，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasomepathway，UPS)是蛋白質(zhì)選擇性降解的主要方式，

2、是細胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，在許多細胞周期性增殖以及凋亡相關(guān)蛋白的降解過程中發(fā)揮著重要作用。UPS可清除真核細胞中突變、損傷以及異常折疊的蛋白質(zhì)，從而起到維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。近年的研究表明，UPS在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病過程中起著重要的作用，尤其是與散發(fā)性PD的關(guān)系密切。散發(fā)性PD患者的黑質(zhì)中含有大量的氧化蛋白，這些蛋白易于發(fā)生聚集，而不易被蛋白酶體所降解。 氧化應激在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生過程中的作用越來越受到

3、人們4的重視。在高濃度的鐵、銅和錳等過渡元素存在的條件下，黑質(zhì)多巴胺區(qū)域自由基的產(chǎn)生大量增加。自由基可以攻擊蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變。通過對蛋白質(zhì)氨基酸殘基的直接氧化可以引起羰基化基團的出現(xiàn)，從而改變蛋白質(zhì)的生物特性如酶的活性。自由基還可以與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應，引起后者的過氧化，從而生成醛類等毒性物質(zhì)。大量的研究表明，脂質(zhì)過氧化反應可能與蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及異常蛋白的蓄積有關(guān)。發(fā)生氧化的蛋白質(zhì)不容易被降解，同時氧化應

4、激還可抑制降解系統(tǒng)的功能。 [目的]了解錳對PC12細胞蛋白酶體活性的影響，以及這種影響在錳所誘導的PC12細胞毒性過程中的作用，并從氧化應激的角度初步探討錳所導致的蛋白酶體活性改變的機制，為防護錳的毒性作用提供理論依據(jù)以及可能的途徑。 [方法]①MTT、TUNEL、姬姆薩染色、流式細胞儀檢測細胞毒性。②特異底物反應檢測蛋白酶體活性的改變。③試劑盒檢測MDA含量以及T-SOD、MnSOD活性的變化，ELISA技術(shù)檢測細胞

5、內(nèi)蛋白羰基化的水平。 [結(jié)果]1.錳對PC12細胞的毒性MTT實驗結(jié)果顯示，在一定濃度的條件下，錳對PC12細胞的增殖抑制呈時間、濃度依賴效應。隨著濃度的增大以及作用時間的延長，錳對PC12細胞增殖的抑制程度逐漸增強。TUNEL、姬姆薩染色均顯示，在作用相同時間的情況下，隨著錳濃度的升高，細胞凋亡率增加。流式細胞儀分析結(jié)果顯示，同樣作用3d，正常對照組細胞無凋亡峰，而300μmol/LMnCl2染毒組細胞凋亡率為25.6％。

6、 2.蛋白酶體活性改變在錳毒性過程中的作用濃度為300μmol/L的MnCl2對蛋白酶體3種酶活性的抑制率隨著作用時間的延長而增高。作用3d后，對3種酶活性的抑制率均超過20％。在作用時間相同的條件下，隨著作用濃度的增高，錳對PC12細胞蛋白酶體活性的抑制作用逐漸增強。同樣作用3d后，當MnCl2濃度達到500μmol/L時，對3種酶活性的抑制率均超過40％。蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘5導與錳相似的毒性作用，表現(xiàn)為抑制PC12細

7、胞的增殖，并誘導其凋亡。 3.氧化應激在錳毒性以及錳所引起的蛋白酶體活性改變中的作用錳能夠引起PC12細胞MDA、蛋白羰基含量的增高以及T-SOD、MnSOD活性的增強，蛋白酶體抑制劑能夠產(chǎn)生與錳相似的效應。加入抗氧化劑之后，錳的毒性受到抑制，表現(xiàn)為對細胞增殖的抑制程度下降，細胞凋亡率降低。 [結(jié)論]1.一定濃度的錳對PC12細胞有明顯的毒性效應，能夠引起細胞增殖的抑制以及凋亡的發(fā)生，這與較早的研究結(jié)果相一致。

8、2.蛋白酶體活性的改變可能是錳誘導的PC12細胞毒性過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。錳能夠引起蛋白酶體活性的下降，并且呈時間、濃度依賴關(guān)系。而蛋白酶體抑制劑能夠產(chǎn)生與錳相似的毒性作用。 3.氧化應激可能是錳所引起的蛋白酶體活性改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。錳能夠引起PC12細胞氧化損傷的加重，氧化應激一方面可以造成蛋白酶體底物的蓄積，另一方面可以引起蛋白酶體降解能力的下降。加入抗氧化劑能夠減輕錳對PC12細胞的毒性作用，并且使蛋白酶體活性在一定程度上得到恢