蛋白酶體活性改變?cè)阱i誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性中的作用研究.pdf

1、[背景]錳是一種機(jī)體必需的微量元素，但過(guò)多的錳進(jìn)入體內(nèi)則會(huì)產(chǎn)生毒性作用。錳的毒性作用主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，慢性錳中毒主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)功能障礙，類似于帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)的癥狀。盡管在具體的作用方面存在一定的差異，錳仍然被看作是PD的重要環(huán)境危險(xiǎn)因素之一。 在真核生物細(xì)胞，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasomepathway，UPS)是蛋白質(zhì)選擇性降解的主要方式，

2、是細(xì)胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，在許多細(xì)胞周期性增殖以及凋亡相關(guān)蛋白的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。UPS可清除真核細(xì)胞中突變、損傷以及異常折疊的蛋白質(zhì)，從而起到維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。近年的研究表明，UPS在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用，尤其是與散發(fā)性PD的關(guān)系密切。散發(fā)性PD患者的黑質(zhì)中含有大量的氧化蛋白，這些蛋白易于發(fā)生聚集，而不易被蛋白酶體所降解。 氧化應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生過(guò)程中的作用越來(lái)越受到

3、人們4的重視。在高濃度的鐵、銅和錳等過(guò)渡元素存在的條件下，黑質(zhì)多巴胺區(qū)域自由基的產(chǎn)生大量增加。自由基可以攻擊蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸殘基的直接氧化可以引起羰基化基團(tuán)的出現(xiàn)，從而改變蛋白質(zhì)的生物特性如酶的活性。自由基還可以與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，引起后者的過(guò)氧化，從而生成醛類等毒性物質(zhì)。大量的研究表明，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可能與蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及異常蛋白的蓄積有關(guān)。發(fā)生氧化的蛋白質(zhì)不容易被降解，同時(shí)氧化應(yīng)

4、激還可抑制降解系統(tǒng)的功能。 [目的]了解錳對(duì)PC12細(xì)胞蛋白酶體活性的影響，以及這種影響在錳所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性過(guò)程中的作用，并從氧化應(yīng)激的角度初步探討錳所導(dǎo)致的蛋白酶體活性改變的機(jī)制，為防護(hù)錳的毒性作用提供理論依據(jù)以及可能的途徑。 [方法]①M(fèi)TT、TUNEL、姬姆薩染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞毒性。②特異底物反應(yīng)檢測(cè)蛋白酶體活性的改變。③試劑盒檢測(cè)MDA含量以及T-SOD、MnSOD活性的變化，ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

5、內(nèi)蛋白羰基化的水平。 [結(jié)果]1.錳對(duì)PC12細(xì)胞的毒性MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定濃度的條件下，錳對(duì)PC12細(xì)胞的增殖抑制呈時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)。隨著濃度的增大以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，錳對(duì)PC12細(xì)胞增殖的抑制程度逐漸增強(qiáng)。TUNEL、姬姆薩染色均顯示，在作用相同時(shí)間的情況下，隨著錳濃度的升高，細(xì)胞凋亡率增加。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，同樣作用3d，正常對(duì)照組細(xì)胞無(wú)凋亡峰，而300μmol/LMnCl2染毒組細(xì)胞凋亡率為25.6％。

6、 2.蛋白酶體活性改變?cè)阱i毒性過(guò)程中的作用濃度為300μmol/L的MnCl2對(duì)蛋白酶體3種酶活性的抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。作用3d后，對(duì)3種酶活性的抑制率均超過(guò)20％。在作用時(shí)間相同的條件下，隨著作用濃度的增高，錳對(duì)PC12細(xì)胞蛋白酶體活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。同樣作用3d后，當(dāng)MnCl2濃度達(dá)到500μmol/L時(shí)，對(duì)3種酶活性的抑制率均超過(guò)40％。蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘5導(dǎo)與錳相似的毒性作用，表現(xiàn)為抑制PC12細(xì)

7、胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。 3.氧化應(yīng)激在錳毒性以及錳所引起的蛋白酶體活性改變中的作用錳能夠引起PC12細(xì)胞MDA、蛋白羰基含量的增高以及T-SOD、MnSOD活性的增強(qiáng)，蛋白酶體抑制劑能夠產(chǎn)生與錳相似的效應(yīng)。加入抗氧化劑之后，錳的毒性受到抑制，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖的抑制程度下降，細(xì)胞凋亡率降低。 [結(jié)論]1.一定濃度的錳對(duì)PC12細(xì)胞有明顯的毒性效應(yīng)，能夠引起細(xì)胞增殖的抑制以及凋亡的發(fā)生，這與較早的研究結(jié)果相一致。

8、2.蛋白酶體活性的改變可能是錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。錳能夠引起蛋白酶體活性的下降，并且呈時(shí)間、濃度依賴關(guān)系。而蛋白酶體抑制劑能夠產(chǎn)生與錳相似的毒性作用。 3.氧化應(yīng)激可能是錳所引起的蛋白酶體活性改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。錳能夠引起PC12細(xì)胞氧化損傷的加重，氧化應(yīng)激一方面可以造成蛋白酶體底物的蓄積，另一方面可以引起蛋白酶體降解能力的下降。加入抗氧化劑能夠減輕錳對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用，并且使蛋白酶體活性在一定程度上得到恢