鎘脅迫下水稻和油菜中microRNA的克隆、鑒定與miR395功能分析.pdf

1、microRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的非編碼的小分子RNAs(small RNA,sRNA)。迄今為止,人們通過生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法分離和鑒定到了大量的 miRNA,并登錄在 miRNA數(shù)據(jù)庫中(http://www.sanger.ac.uk/)。鎘已經(jīng)成為我國農(nóng)田中有毒重金屬污染的主要來源之一,它在植物中積累會(huì)破壞細(xì)胞功能,影響植物生長和發(fā)育。植物對(duì)重金屬脅迫有不同的響應(yīng),其中很顯著的就是,植物根系硫同化以及

2、與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。最近,越來越多的研究揭示了一些miRNA在各種非生物脅迫(如干旱、低溫和機(jī)械力等)中的調(diào)控機(jī)制,然而對(duì)于不同物種中響應(yīng)重金屬脅迫的miRNA的研究甚少。
　　 水稻(Oryza sativa)是世界一種非常重要的糧食作物,而且水稻的全基因組測序已經(jīng)完成,這為我們挖掘到更多的與重金屬脅迫相關(guān)的miRNA提供了基礎(chǔ)。為了獲得新的響應(yīng)脅迫的miRNA,我們構(gòu)建了一個(gè)經(jīng)80μM CdCl2處理的水稻(日

3、本晴)sRNA文庫。在文庫中一共克隆到19個(gè)新的miRNA,均屬于水稻特有的miRNA,分屬于6個(gè)不同的家族。我們還克隆到10個(gè)水稻已知的miRNA,其中9個(gè)為植物中保守序列,另1個(gè)屬于水稻特有的miRNA。另外,在此文庫中我們還發(fā)現(xiàn)56個(gè)不同的其它內(nèi)源性非編碼sRNA。對(duì)新發(fā)現(xiàn)miRNA進(jìn)行了靶基因的預(yù)測后,得到了34個(gè)潛在的基因。進(jìn)一步檢測這6個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族和10個(gè)已知的miRNA在鎘、銅、鋁脅迫下的表達(dá),發(fā)現(xiàn)他們有不同的

4、表達(dá)模式。其中,miR602與其靶基因木葡聚糖內(nèi)?；D(zhuǎn)移酶(xyloglucan endotransglycosylase,XET)以及miR604與其靶基因脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lipid transfer protein,LTP)都存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。這些功能有待于做進(jìn)一步的鑒定。
　　 油菜(Brassica napus)是世界第三大的油料作物。我們在油菜缺硫與重金屬鎘脅迫文庫中克隆到5個(gè)新的保守miRNA,同時(shí)還克隆到2個(gè)與miR3

5、95相關(guān)的硫代謝響應(yīng)基因:BnAPS3(FJ626851)和BnAPS4(FJ626850)。通過生物信息學(xué)和5’RACE實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)了4個(gè)miR395的靶基因:BnSultr2；1,BnAPS1,BnAPS3和BnAPS4。此外,分析了miR395與其靶基因在缺硫脅迫和鎘脅迫下的表達(dá)模式。鎘脅迫和缺硫脅迫均能誘導(dǎo)miR395表達(dá)量增加,但其4個(gè)靶基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。將擬南芥395d前體轉(zhuǎn)入到油菜之中,發(fā)現(xiàn)靶基因表達(dá)被抑制,其表皮

6、毛缺失和發(fā)育延時(shí)等表型變化。
　　 目前研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有6個(gè)miR395的位點(diǎn),調(diào)控4個(gè)不同的與硫代謝相關(guān)的靶基因。為了深入研究miR395調(diào)控功能,我們構(gòu)建了擬南芥miR395c和miR395e前體的過表達(dá)植株,再利用Slim突變體和Mimic395轉(zhuǎn)基因植株分析了它們在正常和缺硫脅迫下的調(diào)控模式.在硫脅迫下,miR395表達(dá)量增加,ATPS1表達(dá)基本不變,ATPS4表達(dá)顯著下調(diào),SULTR2;1表達(dá)上升。相對(duì)于野生型Col

7、-0,miR395過表達(dá)植株的靶基因表達(dá)量明顯下降,而Mimic395轉(zhuǎn)基因植株在兩種條件下的表達(dá)均有所增加。為了揭示在缺硫脅迫下,SULTR2;1的表達(dá)與miR395表達(dá)同時(shí)增加的非負(fù)調(diào)控現(xiàn)象,我們構(gòu)建了將SULTR2；1基因與其自身啟動(dòng)子和GFP蛋白融合(SULTR2;1PRO::SULTR2；1:GFP)的轉(zhuǎn)基因植株。此外,我們還構(gòu)建了SULTR2；1與miR395互補(bǔ)位點(diǎn)點(diǎn)突變的植株(SULTR2；1PRO::SULTR2;1m