BMP-6和VEGF表達載體的構(gòu)建及其促進成骨作用的實驗研究.pdf

1、在美國，每年骨折的發(fā)生大約有600萬次，治療花費大約200億美元。不能自然愈合的骨折稱為骨折不愈合，需要用不同的方法進行手術(shù)治療。由于創(chuàng)傷、骨腫瘤切除及其他病理性因素等引起大塊骨缺損和骨不愈合目前仍然是一個重大的臨床難題。骨組織工程的發(fā)展為提高骨組織再生修復(fù)提供了新的治療思路，組織工程骨移植替代物已被證實是較理想的植骨來源及今后的主要發(fā)展方向。盡管已經(jīng)有很多組織工程骨移植替代物，但治療效果仍然不是很讓人滿意。最近的干細胞生物學(xué)、基因治療

2、和骨誘導(dǎo)基質(zhì)的研究進展促進了攜帶干細胞和生長因子的骨移植替代物的發(fā)展。通過能有效安全的釋放促進骨再生修復(fù)的生長因子的新的移植材料的發(fā)展，可望提高對骨折不愈合、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)溶解、骨壞死和一系列骨異常的治療效果。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)通過影響骨形成的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑在骨再生中發(fā)揮中心作用，這些信號傳導(dǎo)途徑對于通過軟骨內(nèi)骨化過程中調(diào)節(jié)形成新骨的骨祖細胞分化為軟骨細胞和成骨細胞起重要作用。BMP有數(shù)種，其中主要是BMP-2和BMP-7，已

3、經(jīng)被證實能誘導(dǎo)體內(nèi)成骨，并且已經(jīng)應(yīng)用于臨床。在具有骨誘導(dǎo)性的BMP中，以前的研究證實BMP-2，-6和-9是骨誘導(dǎo)性最強的BMP，BMP-7稍弱。這些發(fā)現(xiàn)提示除了已經(jīng)用于臨床的BMP-2和-7，BMP-6和-9至少具有與BMP-2和-7類似的作用。
　　 血管生成對于組織再生修復(fù)是最基本的過程和需要，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是已知的最主要的促血管生長因子。有研究表明，VEGF與BMP-2或BMP-4有協(xié)同作用，但是在干細胞介

4、導(dǎo)的成骨作用方面，VEGF與BMP-4聯(lián)合的效果比與BMP-2的效果更強，這提示VEGF與不同的BMP的相互作用的結(jié)果是不同的。因為有些BMP的成骨作用更強，因此這也可能促進研究骨修復(fù)的骨移植物發(fā)展新的策略。迄今為止，VEGF和BMP-6聯(lián)合在骨修復(fù)中的作用還未見報道。本研究選用BMP-6而不選BMP-9是因為有報道指出，BMP-9能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成作用。聚乳酸羥基乙酸(PLAGA)微球通過熱聚合作用聚集成具有三維空間結(jié)構(gòu)的P

5、LAGA支架已經(jīng)被我們和其他的實驗室廣泛使用。這種支架具有可預(yù)測的、完全整合的孔狀網(wǎng)絡(luò)，因此為細胞的浸潤和隨后的細胞與細胞、細胞與基質(zhì)的相互作用提供了必要的三維微環(huán)境。
　　 據(jù)此，為了研究BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF聯(lián)合在成骨中的作用，本課題構(gòu)建了表達質(zhì)粒pCMV-hBMP-6(pB6)和pCMV-hVEGF(pV)并通過內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)連接編碼BMP-6和VEGF的基因構(gòu)建了表達質(zhì)粒pCMV-hB

6、MP-6-IRES-hVEGF(pVB6)，三者分別能表達出BMP-6、VEGF和BMP6+VEGF。然后我們利用這些重組質(zhì)粒系統(tǒng)觀察了BMP-6、VEGF以及BMP-6和VEGF聯(lián)合對克隆的小鼠前成骨細胞系D1細胞在體外促進成骨分化方面的誘導(dǎo)作用。并將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6轉(zhuǎn)染D1細胞后種植到PLAGA支架材料上，構(gòu)建組織工程骨，體內(nèi)觀察BMP-6、VEGF對D1細胞介導(dǎo)的成骨作用的誘導(dǎo)作用，并觀察BMP-6和VEGF

7、在體內(nèi)促進骨形成方面的協(xié)同作用，為大塊骨缺損的治療研究奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)將本項研究的主要內(nèi)容簡要介紹如下。
　　 第一部分真核表達載體pB6，pV和pVB6的構(gòu)建研究目的：
　　 為了研究BMP-6和VEGF在成骨中的作用，構(gòu)建能表達BMP-6、VEGF和BMP-6+VEGF的重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6。
　　 研究方法：
　　 采用PCR方法克隆人VEGF基因cDNA的片段；將所克隆的基因片段插入pCR

8、2.1-TOPO-TA載體中獲得質(zhì)粒pCR2.1-TOP0.VEGF，采用PvuⅠ和XhoⅠ雙酶切，純化目的基因片段后，插入pShuttle-IRES-hrGFP-1載體中獲得質(zhì)粒pShuttle-VEGF，再經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，純化目的基因片段后，插入質(zhì)粒pEGFP-N1中獲得質(zhì)粒pV(pCMV-hVEGF)。
　　 采用PCR方法克隆人BMP-6基因cDNA的片段；將所克隆的基因片段插入pCR2.1-TOPO-TA載

9、體中，經(jīng)NheⅠ和EcoRⅤ雙酶切，將目的基因片段純化后，插入質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-1中，再經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，將目的基因片段純化后，插入質(zhì)粒pEGFP-N1中獲得質(zhì)粒pB6(pCMV-hBMP-6)。
　　 采用PCR方法以pShuttle-IRES-hrGFP-1為模板，擴增IRES序列，經(jīng)EcoRⅤ和PvuⅠ雙酶切，將純化后的目的基因片段插入pShuttle-VEGF中獲得質(zhì)粒pShuttle

10、-IRES-VEGF。hBMP-6基因cDNA經(jīng)NheⅠ和EeoRⅤ雙酶切，目的基因片段純化后，插入pShuttlc-IRES-VEGF載體中獲得質(zhì)粒pShuttle-hBMP-6-IRES-hVEGF，hBMP-6-IRES-hVEGF片段經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，將目的基因片段純化后，插入質(zhì)粒pEGFP-N1中獲得質(zhì)粒pVB6(pCMV-hBMP-6-IRES-hVEGF)。所構(gòu)建表達質(zhì)粒均進行了雙酶切鑒定和測序鑒定。
　　

11、 結(jié)果：
　　 1.用PCR方法擴增出589bp的人VEGF基因的cDNA片段，經(jīng)電泳鑒定目的基因片段長度正確。
　　 2.重組質(zhì)粒pV經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切得到589bp目的片段和4.7kb大片段，電泳鑒定雙酶切后所獲得的酶切目的基因片段長度正確，經(jīng)測序鑒定所有堿基，結(jié)果顯示與目的基因序列完全一致。
　　 3.用PCR方法擴增出1554bp的人BMP-6基因的cDNA片段，經(jīng)電泳鑒定目的基因片段長度正確。

12、
　　 4.重組質(zhì)粒pB6經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切得到1554bp目的片段和4.7kb大片段，電泳鑒定雙酶切后所獲得的酶切目的基因片段長度正確，經(jīng)測序鑒定所有堿基，結(jié)果顯示與目的基因序列完全一致。
　　 5.用PCR方法擴增出59yop的IRES基因的片段，經(jīng)電泳鑒定目的基因片段長度正確。
　　 6.重組質(zhì)粒pVB6經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切得到2738bp目的片段和4.7kb大片段，電泳鑒定雙酶切后所獲得的酶

13、切目的基因片段長度正確，經(jīng)測序鑒定所有堿基，結(jié)果顯示與目的基因序列完全一致。
　　 結(jié)論：
　　 成功地構(gòu)建了分別表達BMP-6，VEGF及BMP-6和VEGF的重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6，為研究BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF聯(lián)合在成骨作用中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分 BMP-6和VEGF在小鼠前成骨細胞系D1細胞中的表達和促成骨分化的體外研究研究目的：
　　 證明保存的克隆細胞系

14、D1細胞具有干細胞特征；研究重組質(zhì)粒pB6，pVand pVB6轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞系D1細胞后目的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達；并利用所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6體外觀察BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF聯(lián)合在促進小鼠前成骨細胞系D1細胞成骨分化方面的誘導(dǎo)作用。
　　 研究方法：
　　 首先采用流式細胞術(shù)檢測小鼠前成骨細胞系D1細胞表面標(biāo)志，驗證其是否具有干細胞特征。
　　 本部分實驗分為6

15、組：1)基本培養(yǎng)基組(DMEM加10％的胎牛血清)；2)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組(DMEM加10％的胎牛血清，50μg/ml維生素C，10 mM的β-磷酸甘油和10-7M的地塞米松)；3)pN組，pN轉(zhuǎn)染組；4)pV組，pV轉(zhuǎn)染組；5)pB6組，pB6轉(zhuǎn)染組；6)pVB6組，pVB6轉(zhuǎn)染組。經(jīng)RT-PCR和ELISA方法對重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6在D1細胞中目的基因的表達進行鑒定。
　　 采用SensoLyte?pNPP堿性磷酸酶

16、試劑盒檢測各組細胞的堿性磷酸酶活性，利用Von-Kossa染色檢測各組細胞鈣的礦化沉積和實時定量PCR法檢測各組細胞成骨標(biāo)志基因OCN和RunX2的表達量，并通過分析堿性磷酸酶活性變化、鈣的礦化沉積程度及OCN和RunX2的表達量的變化判斷目的基因?qū)1細胞促成骨分化的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式細胞術(shù)顯示，D1細胞上CD44和SCA1的表達呈陽性，而CD34和CD45表達呈陰性，表明保存的克隆細胞系D1細胞屬于

17、干細胞。
　　 2.重組質(zhì)粒pB6，pV and pVB6轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞系D1細胞后，用RT-PCR和ELISA可檢測到重組質(zhì)粒中目的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。
　　 3.用SensoLyte?pNPP堿性磷酸酶試劑盒對堿性磷酸酶活性進行檢測，結(jié)果顯示pB6，pV組堿性磷酸酶活性顯著高于對照組，而pVB6組堿性磷酸酶活性顯著高于pB6和pV組。
　　 4.Von-Kossa染色結(jié)果顯示pVB6組礦化沉

18、積明顯高于其他各組。
　　 5.實時定量PCR檢測結(jié)果顯示成骨標(biāo)志基因OCN和RunX2表達pB6組顯著高于對照組，而pVB6組顯著高于pB6和pV組。
　　 結(jié)論：
　　 驗證了D1細胞干細胞表面標(biāo)志SCA-1和CD44的表達，證明D1細胞具有干細胞特征。通過RT-PCR和ELISA方法檢測了重組質(zhì)粒中目的基因在D1細胞中有相應(yīng)mRNA和蛋白質(zhì)表達。通過堿性磷酸酶活性檢測、Von Kossa染色及實時定量PCR

19、檢測成骨標(biāo)志基因的表達情況，證明了單獨的BMP-6或VEGF在促進小鼠前成骨細胞系D1細胞體外成骨分化方面具有誘導(dǎo)作用，而且二者在促進D1細胞體外成骨分化方面具有協(xié)同作用。
　　 第三部分攜帶BMP-6和VEGF表達基因的組織工程骨的構(gòu)建及其體內(nèi)促成骨作用的研究研究目的：
　　 將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pB6，pV和pVB6轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細胞系D1細胞后種植到聚乳酸羥基乙酸(PLAGA)支架材料上，構(gòu)建組織工程骨。體內(nèi)觀察BM

20、P-6、VEGF對D1細胞介導(dǎo)的成骨作用的誘導(dǎo)作用，并觀察BMP-6和VEGF在體內(nèi)促進骨形成方面的協(xié)同作用。
　　 研究方法：
　　 采用聚乳酸羥基乙酸(PLAGA)支架材料，將細胞或質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞種植到支架材料上，形成組織工程骨，激光掃描共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察D1細胞在PLAGA支架上的貼附及生長情況。
　　 將支架或組織工程骨放于小鼠皮下，體內(nèi)觀察其成骨作用。實驗分為10組：(1)PLAGA支架組

21、(P)；(2)D1細胞種植于PLAGA組(P+D1)；(3)pN種植于PLAGA組(P+pN)；(4)pN轉(zhuǎn)染D1細胞種植于PLAGA組(P+D1pN)；(5)pV種植于PLAGA組(P+pV)；(6)pV轉(zhuǎn)染D1細胞種植于PLAGA組(P+D1pV)；(7)pB6種植于PLAGA組(P+pB6)；(8)pB6轉(zhuǎn)染D1細胞種植于PLAGA組(P+D1pB6)；(9)pVB6種植于PLAGA組(P+pVB6)；(10)pVB6轉(zhuǎn)染D1細胞

22、種植于PLAGA組(P+D1pVB6)。
　　 種植的支架在種植后的第2、3、4周取出并收集標(biāo)本，所有標(biāo)本的骨形成和血管形成的情況分別通過X-線，Micro-CT和組織學(xué)檢測進行定性定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.激光掃描共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示D1細胞在PLAGA支架上貼附及生長良好。
　　 2.X-線結(jié)果顯示，在第三周，P+D1pB6組和P+D1pV組成骨量顯著高于對照組，而P+D1pV

23、B6組成骨量明顯高于P+D1pB6組和P+D1pV組，統(tǒng)計學(xué)分析顯示有顯著性差異o<0.05)；在第四周時P+D1pVB6組成骨量和P+D1pB6組沒有顯著性差異。
　　 3.Micro-CT結(jié)果顯示，在第三周，P+D1pB6組和P+D1pV組成骨量顯著高于對照組，而P+D1pVB6組成骨量明顯高于P+D1pB6組和P+D1pV組，統(tǒng)計學(xué)分析顯示有顯著性差異(p<0.05)；在第四周時P+D1pVB6組成骨量和P+D1pB6組沒

24、有顯著性差異。而且在第2、3周時骨形成首先在支架外側(cè)，到第四周骨形成多時分布于整個支架。
　　 4.組織學(xué)HE染色結(jié)果顯示，P+D1pVB6組骨量形成最多。
　　 5.組織學(xué)Von-Kossa染色結(jié)果顯示，P+D1pVB6組礦化沉積量最多。
　　 6.血管染色結(jié)果顯示，P+D1pVB6組有較多的血管形成，用HE染色進行定量分析，發(fā)現(xiàn)P+D1pVB6組和P+D1pV組的血管量顯著高于其他各組，而P+D1pVB6組和

25、P+D1pV組的血管量沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 證明了PLAGA支架適合轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的D1細胞貼附和生長。將重組質(zhì)粒pV，pB6和pVB6轉(zhuǎn)染D1細胞后種植于PLAGA支架上，構(gòu)建了新的組織工程生物活性骨。經(jīng)X線和Micro-CT檢測，證明單獨BMP-6或VEGF能誘導(dǎo)D1細胞介導(dǎo)的成骨作用，而且證明BMP-6和VEGF在誘導(dǎo)D1細胞介導(dǎo)的成骨作用方面具有協(xié)同作用，其促進骨形成從第二周即開始。組織學(xué)檢測顯示V