BMP-2和HO-1共同表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染對大鼠脂肪干細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  從SD大鼠體內(nèi)提取脂肪組織并分離培養(yǎng)大鼠脂肪基質(zhì)干細胞(Adipose-derivedstromal cells,ADSCs),并通過條件誘導(dǎo)基培養(yǎng)及流式細胞儀檢測鑒定其生物學(xué)特性;在體外構(gòu)建構(gòu)建血紅素氧化酶1(Hemeoxygenase1,HO-1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2,BMP-2)共同高表達慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染大鼠脂肪基質(zhì)干細胞,觀察其增值、凋亡和成骨的影響。

2、r>  方法:
  1.從SD大鼠體內(nèi)提取脂肪組織,使用膠原酶消化,對其進行離心后,獲得大鼠ADSCs,接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并傳代。在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)特點,并通過流式細胞儀對其表面標(biāo)記物進行鑒定,確定為ADSCs后使用條件誘導(dǎo)基進行培養(yǎng),鑒定其成骨及成脂能力。
  2.將購置的含有HO-1和BMP-2目的基因的pUC57載體及實驗室提供的慢病毒表達載體pZsG進行相同位點的酶切并重組,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行擴增,挑

3、取陽性克隆后進行菌落PCR鑒定,結(jié)果為陽性后提取質(zhì)粒,并在293T細胞中包病毒,收取毒液后轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs。通過western blot實驗鑒定轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs內(nèi)是否有HO-1和BMP-2目的基因的表達。3.聯(lián)合前期實驗結(jié)果將細胞分為四組:ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)BMP-2組、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)雙基因組和ADSCs未轉(zhuǎn)導(dǎo)組。采用MTT實驗和克隆形成實驗比較各組的增值能力;通過流式細胞儀分析比較各組凋亡率;通過成骨培養(yǎng)

4、基培養(yǎng)后鏡下觀察并常用Image J定量分析比較各組成骨分化能力。
  結(jié)果:
  1.成功體外分離及培養(yǎng)大鼠ADSCs,在倒置顯微鏡下可見其為梭形或多角形細胞,并呈集落樣生長,通過條件誘導(dǎo)基的培養(yǎng),大鼠ADSCs具有成骨和成脂分化能力,流式細胞儀鑒定結(jié)果CD29、CD44、CD90為陽性表達,具有干細胞特性,而CD45和CD31為陰性表達,排除造血干細胞混雜。成功構(gòu)建含有HO-1和BMP-2的pZsG-HO-1-IRES-

5、BMP-2高表達載體,成功轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs,通過western blot實驗鑒定轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs內(nèi)有HO-1和BMP-2目的基因的表達。
  2.轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs通過MTT實驗和克隆形成實驗鑒定發(fā)現(xiàn)在增值率方面雙基因組增值率低于HO-1組(p<0.05);通過流式細胞分析在凋亡率方面雙基因組增值率高于HO-1組(p<0.05);在成骨分化方面雙基因組增值率低于BMP-2組(p<0.05)。
  結(jié)論:
 

6、 1.通過體外分離,膠原酶消化,密度梯度離心聯(lián)合貼壁方法可成功培養(yǎng)生長穩(wěn)定、增值能力強的大鼠ADSCs,通過條件誘導(dǎo)基的培養(yǎng)及流式細胞鑒定證明其具有成脂及成骨能力,并具有干細胞特性。
  2.成功構(gòu)建含有HO-1和BMP-2的pZsG-HO-1-IRES-BMP-2高表達載體,成功轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs。
  3.BMP-2與HO-1聯(lián)合基因修飾的ADSCs細胞增殖能力較單HO-1基因修飾的ADSCs增殖能力弱。
  4.

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