BMP-2和HO-1共同表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染對大鼠脂肪干細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響.pdf

1、目的：
　　從SD大鼠體內(nèi)提取脂肪組織并分離培養(yǎng)大鼠脂肪基質(zhì)干細胞（Adipose-derivedstromal cells,ADSCs），并通過條件誘導(dǎo)基培養(yǎng)及流式細胞儀檢測鑒定其生物學(xué)特性；在體外構(gòu)建構(gòu)建血紅素氧化酶1（Hemeoxygenase1,HO-1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein2，BMP-2）共同高表達慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染大鼠脂肪基質(zhì)干細胞，觀察其增值、凋亡和成骨的影響。

2、r>　　方法：
　　1.從SD大鼠體內(nèi)提取脂肪組織，使用膠原酶消化，對其進行離心后，獲得大鼠ADSCs，接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并傳代。在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)特點，并通過流式細胞儀對其表面標(biāo)記物進行鑒定，確定為ADSCs后使用條件誘導(dǎo)基進行培養(yǎng)，鑒定其成骨及成脂能力。
　　2.將購置的含有HO-1和BMP-2目的基因的pUC57載體及實驗室提供的慢病毒表達載體pZsG進行相同位點的酶切并重組，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行擴增，挑

3、取陽性克隆后進行菌落PCR鑒定，結(jié)果為陽性后提取質(zhì)粒，并在293T細胞中包病毒，收取毒液后轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs。通過western blot實驗鑒定轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs內(nèi)是否有HO-1和BMP-2目的基因的表達。3.聯(lián)合前期實驗結(jié)果將細胞分為四組：ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1組、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)BMP-2組、ADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)雙基因組和ADSCs未轉(zhuǎn)導(dǎo)組。采用MTT實驗和克隆形成實驗比較各組的增值能力；通過流式細胞儀分析比較各組凋亡率；通過成骨培養(yǎng)

4、基培養(yǎng)后鏡下觀察并常用Image J定量分析比較各組成骨分化能力。
　　結(jié)果：
　　1.成功體外分離及培養(yǎng)大鼠ADSCs，在倒置顯微鏡下可見其為梭形或多角形細胞，并呈集落樣生長，通過條件誘導(dǎo)基的培養(yǎng)，大鼠ADSCs具有成骨和成脂分化能力，流式細胞儀鑒定結(jié)果CD29、CD44、CD90為陽性表達，具有干細胞特性，而CD45和CD31為陰性表達，排除造血干細胞混雜。成功構(gòu)建含有HO-1和BMP-2的pZsG-HO-1-IRES-

5、BMP-2高表達載體，成功轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs，通過western blot實驗鑒定轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs內(nèi)有HO-1和BMP-2目的基因的表達。
　　2.轉(zhuǎn)染后的大鼠ADSCs通過MTT實驗和克隆形成實驗鑒定發(fā)現(xiàn)在增值率方面雙基因組增值率低于HO-1組（p<0.05）；通過流式細胞分析在凋亡率方面雙基因組增值率高于HO-1組（p<0.05）；在成骨分化方面雙基因組增值率低于BMP-2組（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　

6、　1.通過體外分離，膠原酶消化，密度梯度離心聯(lián)合貼壁方法可成功培養(yǎng)生長穩(wěn)定、增值能力強的大鼠ADSCs，通過條件誘導(dǎo)基的培養(yǎng)及流式細胞鑒定證明其具有成脂及成骨能力，并具有干細胞特性。
　　2.成功構(gòu)建含有HO-1和BMP-2的pZsG-HO-1-IRES-BMP-2高表達載體，成功轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs。
　　3.BMP-2與HO-1聯(lián)合基因修飾的ADSCs細胞增殖能力較單HO-1基因修飾的ADSCs增殖能力弱。
　　4.