結(jié)核分枝桿菌HtpG蛋白的表達(dá)純化、結(jié)晶及其與CrRNA的相互作用.pdf

1、目前由世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在2010年，全世界900萬(wàn)人患結(jié)核病，140萬(wàn)人死亡，而這其中95%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)每年新發(fā)結(jié)核病人數(shù)占全球總數(shù)的17%，位居世界第二。因此,對(duì)于結(jié)核病的病原體——結(jié)核分枝桿菌——的致病機(jī)理以及免疫機(jī)制展開深入研究顯得尤為重要。
　　HtpG是原核生物重要的分子伴侶，在抵御外界壓力的過程中有著重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御環(huán)境壓力。其獨(dú)特的性質(zhì)使它成為治療的良好分子

2、靶點(diǎn)。對(duì)于HtpG及其在結(jié)核分枝桿菌中的深入研究可以對(duì)結(jié)核病的治療以及防治提供新的思路。
　　CRISPR系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，對(duì)菌體消滅外來質(zhì)粒和噬菌體以及抵抗和阻止質(zhì)粒及噬菌體的繁殖有著不可忽視的作用。近年來有報(bào)道稱，HtpG對(duì)大腸桿菌中的CRISPR/Cas（CRISPR-associated）系統(tǒng)是必需的。如果HtpG缺失，CRISPR系統(tǒng)將丟失在溶原作用中抵御噬菌體的感染的自殺行動(dòng)并且丟失了免疫能力。

3、然而，當(dāng) HtpG被回補(bǔ)后，CRISPR/Cas系統(tǒng)丟失的活性得到了恢復(fù)。
　　依據(jù)現(xiàn)有的一些研究成果，預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌中同樣存在CRISPR系統(tǒng)，并且HtpG對(duì)CRISPR系統(tǒng)的活性有作用。結(jié)核分枝桿菌中Rv2299c基因?qū)?yīng)的蛋白即HtpG。本文據(jù)此，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的基因組作為模板，對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中的Rv2299c基因進(jìn)行克隆以及融合表達(dá)，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒 pET2

4、8a-Rv2299c，并且在原核中高效表達(dá)。對(duì)純化后的融合蛋白進(jìn)行了結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，初篩長(zhǎng)出來了棒狀晶體。同時(shí)，將 Rv2299c連接到了穿梭載體 pMV261H中，并轉(zhuǎn)入了恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis），采用抗his標(biāo)簽的抗體檢測(cè)重組子已正確表達(dá)HtpG蛋白。
　　在CRISPI數(shù)據(jù)庫(kù)得到結(jié)核分枝桿菌H37Rv的CRISPR的預(yù)測(cè)序列，選取一段CRISPR的序列，在RNA fold web server