結(jié)核分枝桿菌HtpG蛋白的表達純化、結(jié)晶及其與CrRNA的相互作用.pdf

1、目前由世界衛(wèi)生組織報道，在2010年，全世界900萬人患結(jié)核病，140萬人死亡，而這其中95%發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年新發(fā)結(jié)核病人數(shù)占全球總數(shù)的17%，位居世界第二。因此,對于結(jié)核病的病原體——結(jié)核分枝桿菌——的致病機理以及免疫機制展開深入研究顯得尤為重要。
　　HtpG是原核生物重要的分子伴侶，在抵御外界壓力的過程中有著重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御環(huán)境壓力。其獨特的性質(zhì)使它成為治療的良好分子

2、靶點。對于HtpG及其在結(jié)核分枝桿菌中的深入研究可以對結(jié)核病的治療以及防治提供新的思路。
　　CRISPR系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，對菌體消滅外來質(zhì)粒和噬菌體以及抵抗和阻止質(zhì)粒及噬菌體的繁殖有著不可忽視的作用。近年來有報道稱，HtpG對大腸桿菌中的CRISPR/Cas（CRISPR-associated）系統(tǒng)是必需的。如果HtpG缺失，CRISPR系統(tǒng)將丟失在溶原作用中抵御噬菌體的感染的自殺行動并且丟失了免疫能力。

3、然而，當(dāng) HtpG被回補后，CRISPR/Cas系統(tǒng)丟失的活性得到了恢復(fù)。
　　依據(jù)現(xiàn)有的一些研究成果，預(yù)測結(jié)核分枝桿菌中同樣存在CRISPR系統(tǒng)，并且HtpG對CRISPR系統(tǒng)的活性有作用。結(jié)核分枝桿菌中Rv2299c基因?qū)?yīng)的蛋白即HtpG。本文據(jù)此，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的基因組作為模板，對結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中的Rv2299c基因進行克隆以及融合表達，構(gòu)建了原核重組表達質(zhì)粒 pET2

4、8a-Rv2299c，并且在原核中高效表達。對純化后的融合蛋白進行了結(jié)晶實驗，初篩長出來了棒狀晶體。同時，將 Rv2299c連接到了穿梭載體 pMV261H中，并轉(zhuǎn)入了恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis），采用抗his標(biāo)簽的抗體檢測重組子已正確表達HtpG蛋白。
　　在CRISPI數(shù)據(jù)庫得到結(jié)核分枝桿菌H37Rv的CRISPR的預(yù)測序列，選取一段CRISPR的序列，在RNA fold web server