結核分枝桿菌ESAT6和CFP10蛋白的表達、純化及初步應用.pdf

1、目的： 本實驗利用基因工程技術，尋找制備結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)6kDa早期分泌性抗原靶(Early secreted antigenic target-6kDa，ESAT6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(Culture tilt rate protein 10，CFP10)、CFP10-ESAT6重組蛋白的方法和條件，并研究其免疫活性，為研究此三種蛋白作為臨床診斷試劑或預防治療藥物打下基

2、礎。 方法： 1.原核表達載體載體的構建：設計pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6載體構建策略，并運用DNAStar生物軟件預測分析載體基因及重組蛋白的抗原位點。 分別設計ESAT6、CFP10引物，從MTB標準株H37Rv基因組中擴增ESAT6、CFP10片段，在ESAT6、CFP10片段間加入linke合成CFP10-ESAT6融合基因；分

3、別定向克隆入pET32a(+)原核表達載體多克隆位點中，再經PCR、酶切等方法鑒定并測序，篩選陽性重組子。 2.重組ESAT6、CFP10、CFP10-ESAT6蛋白(rESAT6、rCFP10、rCFP10-ESAT6)的表達與純化分別在不同濃度IPTG、不同時間、不同溫度條件下對重組菌進行誘導，并進行SDS-PAGE電泳分析，優(yōu)化誘導條件，Western-blotting檢測、鎳柱純化目的蛋白。 3.表達蛋白的免疫活

4、性與初步應用 ①將上述3個重組蛋白分別加弗氏佐劑每隔14d免疫小鼠三次。 ②將rESAT6蛋白和PPD分別體外刺激rESAT6蛋白免疫小鼠的脾淋巴細胞，MTT法檢測淋巴細胞增殖水平。 ③rESAT6蛋白作為包被抗原與單抗HYB076-08作方陣滴定，rCFP10、rCFP10-ESAT6兩蛋白的包被量參考rESAT6濃度，三種蛋白都與陰性血清做方陣滴定，確定抗原抗體的最佳工作濃度，間接ELISA法檢測免疫小鼠血清

5、抗體，評估表達蛋白的免疫活性。 ④在檢測免疫小鼠血清的ELISA法基礎上，用rESAT6蛋白作為包被抗原與單抗HYB076-08作方陣滴定，PPD組與陽性結核猴血清作方陣滴定，確定抗原抗體的最佳工作濃度，以PPD為平行參照組，以rESAT6蛋白對結核病猴(PPD皮試陽性、X光透視陽性)、健康猴(PPD皮試陰性、X光透視陰性)分別進行檢測，以確定rESAT6蛋白ELISA法檢測猴結核的有效性。 ⑤用上述rESAT6蛋白為抗

6、原ELISA檢測猴血清抗體的方法，以PPD ELISA方法檢測方法為對照，檢測10只待檢猴血清(同時設立陰性、陽性、空白對照)，檢測結果與PPD ELISA、PPD皮試對比分析，初步應用于猴結核的檢測。 結果 1.DNAstar預測分析結果表明外源基因大小正確，讀碼框無移位，重組蛋白的抗原位點未被掩蔽。經酶切、PCR、測序鑒定，表明pET32a((+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CF

7、P10-ESAT6三個原核表達載體構建成功。 2.重組目的蛋白的最佳誘導條件為IPTG濃度為1mM，25℃誘導6h，成功獲得rESAT6、rCFP10及rCFP10-ESAT6融合蛋白，可溶性目的蛋白表達量分別占全菌可溶性總蛋白的35.5％、38.1％、18.7％，分離純化后每g工程菌可獲得的可溶性目的蛋白量達2.247mg-6.536mg。 3.Western-blotting結果顯示rESAT6蛋白與ESAT6單抗H

8、YB076-08相互反應，在2.5×104左右有一條特異的印記帶。 4.ESAT6蛋白及PPD刺激免疫后小鼠脾淋巴細胞，rESAT6組脾淋巴細胞增殖刺激指數(shù)SI為2.232±0.10，PPD平行組SI為2.283±0.12。 5.三種重組蛋白均能刺激小鼠產生相應抗體。其中rCFP10-ESAT6蛋白抗體OD值明顯高于rESAT6和rCFP10組(P<0.05)。 6.初步建立并驗證了用rESAT6蛋白作為包被抗原

9、與單抗HYB076-08作方陣滴定ELISA檢測猴血清相應抗體方法。用方陣法確定了抗原包被量為100ng/孔，一抗猴血清稀釋度為1:40，標記二抗稀釋度為1:5000，以rESAT6蛋白為包被抗原ELISA法檢測結核病猴和健康猴血清檢測結果分別為陽性和陰性。 7.以rESAT6初步作為抗原檢測待測猴血清相應抗體，結果10個樣品中9個與PPD ELISA檢測、PPD皮試結果一致，符合率為9/10。 結論： 1.成功

10、構建pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6原核表達載體，建立較好表達條件，并大量獲得純化蛋白。 2.以表達蛋白為抗原刺激正常小鼠，MTT法檢測到免疫后小鼠脾淋巴細胞增殖，ELISA法檢測免疫小鼠蛋白抗體，表明rESAT6、rCFP10和rCFP10-ESAT6蛋白在細胞免疫和體液免疫方面均有免疫活性。 3.初步建立并應用rESAT6蛋白作為抗原ELISA