結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白的表達(dá)及其特性探討.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建MTB ClpC2基因原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸埃希菌（Escherichia.coli,E.coli）BL21中表達(dá)rClpC2蛋白;rClpC2蛋白經(jīng)親和層析法純化后免疫新西蘭大白兔，制備兔抗ClpC2多克隆抗體（anti-rClpC2抗血清）;間接ELISA法檢測(cè)肺結(jié)核病人血清中相應(yīng)的抗原、抗體，判斷rClpC2和anti-rClpC2抗血清分別作為檢測(cè)抗原或抗體的特異性和敏感性，為結(jié)核病早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在E

2、.coli BL21中過表達(dá)重組蛋白，觀察E.coli BL21在各種應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)情況，為后續(xù)深入研究MTB ClpC2蛋白酶的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以MTB H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ClpC2基因，插入表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western-blot對(duì)

3、表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　2.純化后的rClpC2與等體積的弗氏佐劑充分混合，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔，于第五次免疫后的第七天采血，通過Western-blot檢測(cè)anti-rClpC2抗血清的特異性;雙向免疫擴(kuò)散法和間接ELISA檢測(cè)anti-rClpC2抗血清的效價(jià);rClpC2通過間接ELISA進(jìn)行抗原性的初步檢測(cè)，anti-rClpC2抗血清通過間接ELISA檢測(cè)肺結(jié)核病人血清中ClpC2抗原，判斷rClpC2和兔

4、抗ClpC2多克隆抗體分別作為檢測(cè)抗原或抗體的特異性和敏感性。
　　3.通過檢測(cè)各組菌液OD600觀察過表達(dá)ClpC2或ClpP1蛋白及共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白的E.coli BL21的生長(zhǎng)曲線及其在氧化應(yīng)激、酸應(yīng)激、堿應(yīng)激、乙醇應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)狀況;采用結(jié)晶紫半定量法檢測(cè)蛋白過表達(dá)對(duì)E.coli BL21生物膜形成的影響。
　　結(jié)果:
　　1.重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/ClpC2雙向測(cè)序結(jié)果顯示與C

5、lpC2基因序列完全一致，表達(dá)的融合蛋白Trx-ClpC2相對(duì)分子質(zhì)量為46000，可與MTB H37Rv株免疫的小鼠血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
　　2.純化的rClpC2純度約為88.5％，Western-blot驗(yàn)證anti-rClpC2抗血清的特異性;ELISA測(cè)得anti-rClpC2抗血清的效價(jià)為1∶320000，雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)得anti-rClpC2抗血清的效價(jià)為1∶32; rClpC2在檢測(cè)肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗體檢出率

6、為46％，檢測(cè)敏感性為46％，特異性為90％; anti-rClpC2抗血清在檢測(cè)肺結(jié)核病人中的相應(yīng)抗原檢出率為40％，檢測(cè)的敏感性為40％，特異性為90％。
　　3.過表達(dá)ClpP1蛋白的E.coli BL21對(duì)過氧化氫的耐受增加，共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21的生長(zhǎng);共表達(dá)ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21抵抗酸應(yīng)激、堿應(yīng)激;重組蛋白的過表達(dá)并未對(duì)E.coli BL21生物膜的