Rv0341蛋白在結(jié)核分枝桿菌中的表達(dá)及其診斷依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌感染結(jié)核病的臨床價(jià)值研究.pdf

1、背景: 依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌簡稱依R菌(Rifampin-dependent Mycobacteriumtuberculosis)是指某些結(jié)核分枝桿菌依賴?yán)Ｆ?Rifampin，RFP/R)生長的現(xiàn)象，是比耐藥性變異更為嚴(yán)重的生物現(xiàn)象。依R菌感染的結(jié)核患者具有病情重、耐多藥、化療效果差和預(yù)后不良的臨床特征，如果此類患者繼續(xù)使用利福平，可導(dǎo)致病情加重，是化療失敗和難治性結(jié)核病產(chǎn)生的重要原因之一，因此依R菌結(jié)核病的早期診斷對臨床

2、治療及預(yù)后有重大意義。 目的:本研究對依R菌中高表達(dá)的Rv0341蛋白進(jìn)行分析，對其編碼基因iniB進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphisma，RFLP)。利用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)Rv0341，純化后鑒定重組蛋白的免疫原性和抗原性。建立以重組蛋白R(shí)v0341為靶抗原檢測血清Rv0341抗體的斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)(DIGFA)，探討其在依R菌結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)

3、值，為進(jìn)一步研究開發(fā)依R菌結(jié)核病診斷試劑盒提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法: 1.通過SDS-PAGE、免疫印跡分析Rv0341在結(jié)核桿菌R依賴株、耐受株和敏感株中表達(dá)的差異，RFLP鑒定Rv0341蛋白編碼基因iniB的多態(tài)性。 2.自結(jié)核分枝桿菌H37Rv擴(kuò)增iniB基因，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建于pET22b(+)表達(dá)載體，酶切、測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni2+親

4、和層析純化目的蛋白。鑒定其免疫原性和抗原性：以重組Rv0341蛋白免疫家兔，檢測產(chǎn)生Rv0341抗體的效價(jià)；典型依R菌肺結(jié)核患者(陽性)血清、健康人(陰性)血清分別與重組蛋白進(jìn)行Western-blot。 3.以重組蛋白R(shí)v0341為靶抗原建立檢測血清Rv0341抗體診斷依R菌結(jié)核病的DIGFA法。 4.以上述建立的方法對患者(依R菌、R敏感菌、R耐藥菌感染的結(jié)核病患者) 結(jié)果: 1.SDS-PAGE、免

5、疫印跡證實(shí)Rv0341在依R菌中高表達(dá)，表達(dá)量與R敏感菌和耐R菌有明顯差異。RFLP證實(shí)其編碼基因iniB在不同類型的結(jié)核桿菌(R敏感菌、耐R菌、依R菌)中不具有多態(tài)性，是保守基因。 2.成功構(gòu)建了表達(dá)重組蛋白R(shí)v0341的工程菌，經(jīng)超聲破菌、SDS-PAGE、UVP掃描證實(shí)重組蛋白表達(dá)量約占總蛋白的25％，主要以包涵體形式表達(dá)。用N12+親和層析柱對目的蛋白純化，獲得純度為95％的重組蛋白。純化重組蛋白免疫家兔產(chǎn)生了效價(jià)≥1：

6、100000的抗Rv0341抗體，與典型依R菌肺結(jié)核患者陽性血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白具有良好的免疫原性及抗原性。 3.建立了以重組蛋白R(shí)v0341為靶抗原的診斷依R菌結(jié)核病DIGFA法，該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。檢測95份結(jié)核病患者血清，其診斷依R菌結(jié)核病的靈敏度為95.8％，特異性為81.7％，準(zhǔn)確度為85.3％。 結(jié)論: 1.RFLP結(jié)果證實(shí)iniB為保守基因，不同菌株Rv0341蛋白表達(dá)方面的差異不