Toll樣受體在冠心病單個核細(xì)胞中的表達及其機制的研究.pdf

1、冠心病(CHD)是一種慢性免疫炎癥性疾病，慢性免疫炎癥反應(yīng)損傷血管，引起脂質(zhì)浸潤，平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致斑塊形成，炎癥免疫反應(yīng)又可以促進斑塊的發(fā)展，但是，免疫炎癥反應(yīng)在CHD中的具體機制還不完全清楚。Toll樣受體(TLR)是1988年Hashimoto等在果蠅中發(fā)現(xiàn)一種屬于I型跨膜蛋白的受體，Medzhitov等在1997年首次鑒定出與果蠅同源的第一個人類細(xì)胞表面的Toll樣蛋白，現(xiàn)今已經(jīng)克隆的人TLR家族成員至少有10個，分別命名為T

2、LR1-10。TLR在人許多組織細(xì)胞中均有表達，但主要還是表達在單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上。TLR與外源性和內(nèi)源性配體結(jié)合，通過其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑觸發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)。TLR在免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中的作用已開始受到人們的關(guān)注。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實時定量-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)和流式細(xì)胞術(shù)檢測健康人和CHD患者外周血單個核細(xì)胞中TLR1-10 mRNA的組成型表達，分析TLR1-10

3、mRNA的表達與冠心病危險因素積聚性的關(guān)系。進一步探討冠心病危險因素氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)和高糖對體外培養(yǎng)單個核細(xì)胞TLR1-10 mRNA的表達及其下游炎癥因子腫瘤壞死因子-a(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的影響。為進一步揭示CHD的發(fā)病機制，尋求有效的防治措施提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分人外周血單個核細(xì)胞Toll樣受體的表達
　　 目的:觀察人外周血單個核細(xì)胞TLR1-10 mRNA各亞型的

4、表達狀況，為進一步研究TLR功能尋找合適細(xì)胞。
　　 方法:分離人外周血中的單個核細(xì)胞，用RT-PCR和Real-time PCR檢測健康人單個核細(xì)胞中TLR1-10 mRNA的組成型表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR擴增結(jié)果以單個核細(xì)胞mRNA為模板，擴增cDNA片段，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2％瓊脂糖凝膠電泳顯示:1-10泳道均有核酸條帶，且條帶的大小與TLR1-10引物設(shè)計的理論值一致，說明人單個核細(xì)胞有T

5、LR1-10 mRNA的組成型表達。
　　 2.Real-time PCR檢測TLR1-10的組成型表達將單個核細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以同一管cDNA為模板，同時擴增TLR1-10和GAPDH。這樣可減少因模板不同所造成的TLR1-10之間的差異。TLR1、2、4、6的mRNA表達量較高，而TL，RTmRNA的表達量相對較少。
　　 結(jié)論:人外周血中單個核細(xì)胞有TLR1-10mRNA的表達，單個核細(xì)胞可作為研

6、究TLR功能的細(xì)胞。
　　 第二部分冠心病外周血單個核細(xì)胞Toll樣受體的表達及其與冠心病危險因素聚集性的關(guān)系
　　 目的:觀察CHD患者外周血單個核細(xì)胞TLR1-10的表達狀況及其與CHD危險因素聚集性的關(guān)系，探尋TLR1-10在CHD發(fā)病機制中的作用。
　　 方法:急性冠脈綜合征(ACS)、慢性心肌缺血綜合征(CIS)患者和正常健康者各30例，用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個核細(xì)胞TLR1-10的表達。搜集血壓、血

7、糖、血脂，吸煙史及家族史等危險因素，計算危險因素積分。應(yīng)用方差分析TLR1-10在各組中的陽性率情況，相關(guān)分析研究CHD危險因素積分與TLR1-10陽性率的關(guān)系。
　　 結(jié)果:在急性ACS組、CIS組中，外周血單個核細(xì)胞TLR2-5表達的陽性率均顯著高于健康對照組，TLR2、4、5在ACS組的表達陽性率均顯著高于CIS組，其他亞型在各組間無顯著差異。相關(guān)分析顯示，外周血中單個核細(xì)胞TLR2-5表達的陽性率與CHD危險因素積分呈正

8、相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.438，0.632，0.303，0.526，P<0.05或P<0.01。
　　 結(jié)論: CHD外周血中單個核細(xì)胞TLR2-5表達的陽性增多，TLR2、4、5還可能反映CHD的嚴(yán)重程度；TLR2-5的表達與CHD危險因素聚集性有關(guān)。
　　 第三部分氧化性低密度脂蛋白對人單個核細(xì)胞Toll樣受體表達及炎癥介質(zhì)的影響
　　 目的:探討ox-LDL對單個核細(xì)胞TLR1-10表達的影響及及其下游炎

9、癥因子TNF-α、IL-6的調(diào)控作用。
　　 方法:用Real-timePCR檢測ox-LDL刺激單個核細(xì)胞后，TLR1-10 mRNA表達的變化；結(jié)合抗體阻斷實驗，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的含量。
　　 結(jié)果:ox-LDL刺激可上調(diào)入單個核細(xì)胞TLR2、4 mRNA的表達。經(jīng)ox-LDL刺激后，單個核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6上升，抗體阻斷TLR2、4，可以減少ox-LDL誘

10、導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌。
　　 結(jié)論:ox-LDL可能是Toll樣受體2、4的內(nèi)源性配體，ox-LDL可通過Toll樣受體2、4信號通路調(diào)節(jié)單個核細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的生成。
　　 第四部分高糖對人單個核細(xì)胞Toll樣受體表達及炎癥介質(zhì)的影響
　　 目的:探討在高濃度葡萄糖的條件下，體外培養(yǎng)單個核細(xì)胞TLR1-10的表達及炎癥因子TNF-α、IL-6的變化，進一步探索高糖在動脈粥樣硬化免疫炎癥反應(yīng)中的作用。

11、r>　　 方法:用Real-timePCR.檢測在高濃度葡萄糖的條件下，單個核細(xì)胞TLR1-10mRNA表達的變化。結(jié)合抗體阻斷實驗，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的表達。
　　 結(jié)果:高濃度葡萄糖可上調(diào)TLR3、5 mRNA的表達。同時高濃度葡萄糖促進TNF-α、IL-6的生成，抗體阻斷TL，R3、5后，可以減少高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌。
　　 結(jié)論:高濃度葡萄糖上調(diào)TLR3、