Toll樣受體4在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其作用研究.pdf

1、目的:本研究擬檢測(cè)TLR4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，探討TLR4對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　方法:
　　1、采用RT-PCR方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251-MG中TLR4的mRNA表達(dá)情況。
　　2、采用Western Blot方法檢測(cè)U251-MG細(xì)胞中TLR4的蛋白表達(dá)情況。
　　3、構(gòu)建TLR4 siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至U251-MG細(xì)胞。采用RT-PCR方法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后U251-MG細(xì)胞中TLR4的

2、mRNA表達(dá)情況。
　　4、采用Westem Blot方法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后U251-MG細(xì)胞中TLR4的蛋白表達(dá)情況。
　　5、采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)TLR4基因沉默前后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響。
　　6、采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4基因沉默前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性。
　　7、采用ELISA法檢測(cè)TLR4基因表達(dá)沉默前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10和VEGF含量變化。
　　結(jié)果:
　　1、RT

3、-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251-MG中可檢測(cè)到TLR4mRNA表達(dá)。
　　2、Westem Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251-MG中可檢測(cè)到TLR4蛋白表達(dá)。
　　3、將TLR4 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251-MG細(xì)胞后，檢測(cè)TLR4的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA質(zhì)粒24h后，U251-MG細(xì)胞中TLR4 mRNA表達(dá)水平(0.138±0.0004)比轉(zhuǎn)染空載體組(1.003±

4、0.0005)、未轉(zhuǎn)染組(1.034±0.0006)顯著降低(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染空載體組與未轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、將TLR4 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251-MG細(xì)胞后，檢測(cè)TLR4的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體組(0.900±0.0062)、未轉(zhuǎn)染組(1.007±0.0029)相比，轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA基因24h后，U251-MG細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平(0.200±0.0042)顯著降低(P＜0

5、.05）。轉(zhuǎn)染空載體組與未轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空載體和轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA的U251-MG細(xì)胞，經(jīng)10μg/ml LPS作用48h，與未經(jīng)LPS作用時(shí)相比，三組細(xì)胞S期細(xì)胞比例均明顯增高，G0/G1期細(xì)胞比例下降(P＜0.05);在LPS刺激情況下，轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞相比，S期細(xì)胞比例顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例增高（P＜0.05）。

6、
　　6、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)10μg/ml LPS刺激后，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組相比，轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05）。
　　7、ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)10μg/ml LPS作用12h后，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組相比，轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA組U251-MG細(xì)胞分泌IL-6，IL-10，VEGF的含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251-MG表