TOLL樣受體9在胃癌中的表達及其在發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,但對它的發(fā)病機制目前尚不十分清楚。已有研究證實病原體對人體感染導(dǎo)致慢性炎癥,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因為病原體和腫瘤細胞Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)之間的相互作用所產(chǎn)生的信號改變腫瘤微環(huán)境中多種細胞因子的水平,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和調(diào)節(jié)或影響著腫瘤細胞的生存、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移。Toll樣受體9(Toll-like receptor9,TLR9)作為TLRs的主要成員

2、之一,主要識別細菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脫氧核糖核酸(CpG-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN),已有研究證實,多種腫瘤細胞表達TLR9。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是人類胃癌的主要致病因子,1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將H.pylori列為胃癌的Ⅰ類致癌因子,細菌本身含有致炎或致癌因子可能起了關(guān)鍵作用。H.pylori為一種革蘭氏陰性細菌,

3、DNA中富含有CpG-ODN,是TLR9的配體,已有研究證實,H.pylori DNA能被樹突狀細胞表達的TLR9識別,這些發(fā)現(xiàn)對H.pylori感染與胃癌發(fā)病機制的研究提供了一個新的視點。目前關(guān)于TLR9在胃癌組織中表達情況的報道甚少,其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系尚無相關(guān)研究。也有研究證實H.pylori與胃癌的發(fā)病有關(guān),但目前無H.pylori DNA與胃癌發(fā)病機制的相關(guān)研究,我們假說由于胃組織中TLR9的表達使H.pylori通過他

4、們的成份對胃癌的形成和發(fā)展有影響,探討TLR9信號通路和H.pylori感染與胃癌發(fā)病機制的關(guān)系,以期為胃癌的臨床治療提供更多的理論依據(jù)。本研究分以下三部分進行研究。
　　 第一部分 Toll樣受體9在胃癌組織中的表達及其臨床意義
　　 目的:
　　 從蛋白水平研究TLR9在胃癌組織、癌旁胃組織和遠癌旁胃組織中的表達情況,分析TLR9-與患者的性別、胃癌進展程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌分化程度和臨床分期等臨床病理資

5、料的相關(guān)性,探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床特征之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 本研究中采用134例胃癌組織、80例癌旁胃組織和80例遠癌旁胃組織作為組織芯片,采用免疫組化法檢測TLR9蛋白的表達情況。同時,我們收集了36例新鮮胃癌組織及相應(yīng)的癌旁胃組織和遠癌旁胃組織標(biāo)本,用免疫印跡法(Western blot)進一步驗證TLR9蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 134例胃癌組織中,TLR9蛋白表達陽性1

6、04例,陰性30例,陽性率為77.6％,癌旁胃組織80例,TLR9蛋白表達陽性49例,陰性31例,陽性率為61.3％,遠癌旁胃組織80例,TLR9蛋白表達陽性32例,陰性48例,陽性率為40％,胃癌組織TLR9蛋白的表達明顯高于癌旁胃組織和遠癌旁胃組織(P<0.05),且癌旁胃組織中的TLR9表達顯著高于遠癌旁胃組織(P<0.05)。胃癌組織中TLR9的表達與胃癌分化程度密切相關(guān)(P<0.05),分化越低,惡性度越高,TLR9的表達就越

7、低。且我們檢測了8例胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié),發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)中,轉(zhuǎn)移的胃癌細胞有TLR9的表達。在36例新鮮標(biāo)本中,Western blot方法進一步證實了在胃癌組織上存在TLR9的表達,且明顯高于癌旁胃組織和遠癌旁胃組織。
　　 結(jié)論:
　　 TLR9在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁胃組織和遠癌旁胃組織,且TLR9的表達與腫瘤組織分化程度有關(guān),惡性度越高,TLR9的表達就越低。
　　 第二部分 H.pylori DNA促進S

8、GC-7901細胞Toll樣受體9表達的研究
　　 目的:
　　 研究TLR9是否在胃癌細胞株SGC7901中表達以及用CpG-ODN和兩種H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,SGC7901細胞中TLR9蛋白的表達情況。
　　 方法:
　　 分別用CpG-ODN和兩種H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA刺激SGC7901細胞,使用流式細胞分析

9、和Western blot對SGC7901細胞表達的TLR9蛋白進行檢測。
　　 結(jié)果:
　　 在SGC-7901細胞中,沒有CpG-ODN、H.pylori DNA刺激時,有少量TLR9蛋白表達,經(jīng)CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,TLR9蛋白的表達明顯增加(p<0.05),且具有刺激濃度和刺激時間的依賴性。進一步發(fā)現(xiàn)CPG-ODN刺激組SGC-7901細胞TLR9

10、蛋白的表達顯著高于H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)組(p<0.05),兩種不同的H.pyloriDNA刺激后,TLR9表達無明顯差異(p>0.05)。Western blot分析進一步證實SGC7901細胞經(jīng)CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,TLR9表達明顯增加(p<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 SGC-7901細胞刺激前表達少量TLR9

11、蛋白,經(jīng)CpG-ODN、H.pylori DNA刺激后,SGC-7901細胞的TLR9蛋白表達顯著增加。
　　 第三部分 H.pylori DNA通過TLR9通路促進SGC-7901細胞表達細胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的研究
　　 目的:
　　 研究H.pylori DNA是否通過TLR9通路促進SGC-7901細胞細胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達。
　　 方

12、法:
　　 用CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA刺激SGC-7901細胞后,通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達情況,并用TLR9阻斷劑Chloroquine預(yù)處理后檢測SGC-7901細胞細胞因子的表達,同時應(yīng)用Western blot檢測了NF-κ BP65、P38、P42和Akt的激活情況。
　　 結(jié)果:
　　

13、 在SGC-7901細胞中,兩種H.pylori DNA和CpG-ODN刺激后,均能增加細胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達,并具有刺激濃度和時間的依賴性；進一步發(fā)現(xiàn)CPG-ODN刺激組四種細胞因子的表達顯著高于NCTC12908DNA刺激組(p<0.05),CpG-ODN刺激組MMP9的表達顯著高于NCTC11637DNA刺激組(p<0.05),但TGF-β1,VEGF和MMP2的表達無顯著差異(p>0.05)。

14、NCTC11637DNA刺激組TGF-β1、VEGF和MMP9三種細胞因子的表達顯著高于NCTC12908DNA刺激組(p<0.05),但MMP2的表達無顯著性差異,(p>0.05)。TLR9阻斷劑Chloroquine可以抑制四種細胞因子的上調(diào)表達。同時,SGC-7901細胞經(jīng)H.pylori DNA和CpG-ODN刺激后,可激活NF-κB通路蛋白P65、MAPK通路相關(guān)蛋白p38及p42和PI3K／Akt通路相關(guān)蛋白Akt的磷酸化。