程序化凍存兔膀胱粘膜異體移植治療尿道狹窄實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分模擬TUR環(huán)境建立新西蘭大白兔尿道狹窄模型。
　　目的:模擬TUR環(huán)境,研究TUR手術(shù)后尿道狹窄發(fā)生原因,探索新西蘭大白兔尿道狹窄模型建立方法。
　　方法:將20只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分成兩組,每組10只,平均體重(2.0±0.1)kg。在戊巴比妥鈉溶液靜脈注射麻醉后,第一組單純剝除1.0cm左右尿道粘膜,逐層縫合后留置F-8導(dǎo)尿管并固定。第二組在第一組基礎(chǔ)上再用雙極電凝灼燒尿道粘膜創(chuàng)面,所有操作均在10倍光鏡下,運(yùn)

2、用顯微器械完成。術(shù)后觀察兩組實(shí)驗(yàn)兔,在飼養(yǎng)至一個(gè)月、兩個(gè)月時(shí)分別行順行膀胱尿道造影。在兩月時(shí)進(jìn)行手術(shù)部位組織切片H.E.染色光鏡檢查。
　　結(jié)果:第一組實(shí)驗(yàn)兔在術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)死亡2只,第二組死亡1只,余下完成實(shí)驗(yàn)。術(shù)后1周左右,留置導(dǎo)尿管自行脫落。觀察發(fā)現(xiàn)第二組術(shù)后一月后明顯較第一組焦躁。術(shù)后一個(gè)月順行膀胱尿道造影兩組均未見(jiàn)明顯狹窄。而術(shù)后兩個(gè)月時(shí)第二組尿道造影9只均出現(xiàn)明顯狹窄,尿道管腔變細(xì),粘膜粗糙不連續(xù),而第一組僅2只出現(xiàn)狹窄癥

3、狀。造模成功實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)部位組織切片H.E.染色光鏡檢查結(jié)果提示大量纖維結(jié)締組織沉積,缺乏尿道上皮生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:TUR手術(shù)時(shí)過(guò)度的電灼傷是引起術(shù)后尿道狹窄的重要原因,模擬TUR環(huán)境電灼損傷尿道可以穩(wěn)定建立兔尿道狹窄模型,可以用于長(zhǎng)段尿道狹窄治療的研究。
　　第二部分程序化冷凍保存對(duì)兔膀胱粘膜免疫原性影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究程序化冷凍保存對(duì)兔膀胱粘膜免疫原性及其在同種異體移植后引起排斥反應(yīng)的影響,并探索其可能機(jī)制

4、。
　　方法:取6只新西蘭兔,分為3對(duì),每對(duì)實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)標(biāo)記為A或B,分別取膀胱粘膜(分為凍存和未凍存兩組)和脾臟,進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)膀胱粘膜免疫原性的變化。將12只新西蘭兔制成尿道狹窄模型,用未凍存和凍存的膀胱粘膜分別進(jìn)行管狀覆蓋移植,另取6只新鮮兔設(shè)正常對(duì)照,移植2周后,取被移植兔的血液和脾臟用于淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),檢測(cè)程序化冷凍保存對(duì)兔膀胱粘膜引起的免疫排斥反應(yīng)的影響;同時(shí)取移植部位的尿道,進(jìn)行CD3、CD4和CD8免疫

5、組化染色,檢測(cè)同種異體移植造成的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。另取6只正常新西蘭兔的膀胱粘膜,分為未凍存粘膜組和凍存粘膜組,提取mRNA,對(duì)RLA-Ⅰ、RLA-Ⅱ和RLA-Ⅲ基因進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果:混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)程序化冷凍的粘膜細(xì)胞刺激異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的強(qiáng)度明顯比未冷凍組弱,表現(xiàn)出極顯著的差異;淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明受體接受未經(jīng)程序化冷凍的粘膜移植之后,其血液淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞增殖速度明顯高于凍存粘膜移植組;免疫組化染

6、色表明,冷凍移植組CD3、CD8陽(yáng)性率及積累光密度明顯小于未冷凍移植組;定量PCR實(shí)驗(yàn)表明,三類RLA基因的表達(dá)在凍存前后沒(méi)有明顯差異。
　　結(jié)論:程序化冷凍降低了兔膀胱粘膜的免疫原性,減輕了其在同種異體移植后引起的免疫排斥反應(yīng)的強(qiáng)度。
　　第三部分冷凍兔膀胱粘膜管狀覆蓋治療尿道狹窄實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:明確程序化冷凍保存技術(shù)能夠較好保護(hù)組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu),并通過(guò)觀察程序化冷凍處理的膀胱粘膜移植片治療尿道狹窄的手術(shù)效果,并與

7、未經(jīng)處理的對(duì)照組作比較,明確冷凍后異體兔膀胱粘膜是替代尿道成形術(shù)的良好材料。
　　方法:取6只新西蘭兔膀胱粘膜,將其分成冷凍組及未冷凍組。(1)比較冷凍前后膀胱粘膜片光鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變。(2)比較冷凍前后膀胱粘膜片電鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變。將12只雄性新西蘭大白兔,平均體重(2.1±0.2)kg,分為兩組,每組6只,制成尿道狹窄模型。另取6只兔子經(jīng)3％的戊巴比妥鈉溶液靜脈麻醉后,每只取下新鮮膀胱粘膜裁剪成等大兩塊10*8mm粘膜片,

8、其中一塊經(jīng)程序化冷凍保存。隨機(jī)從兩組實(shí)驗(yàn)兔中各取一只組成一組,冷凍組應(yīng)用程序化冷凍處理后的兔膀胱粘膜治療,手術(shù)方式采取粘膜管狀替代成型,對(duì)照組應(yīng)用未經(jīng)處理的粘膜片治療。(3)比較手術(shù)后2周兩組手術(shù)部位大體標(biāo)本。(4)比較手術(shù)后2周兩組手術(shù)部位HE染色后病理切片結(jié)果。(5)比較術(shù)后2月兩組實(shí)驗(yàn)兔尿道造影結(jié)果。(6)比較術(shù)后2月手術(shù)部位組織HE染色后病理切片結(jié)果。
　　結(jié)果:(1)冷凍前后膀胱粘膜片光鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯破壞,但粘膜

9、表面有少許細(xì)胞脫落。(2)冷凍前后膀胱粘膜片電鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變。(3)術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組手術(shù)部位炎癥反應(yīng)明顯較對(duì)照組輕。(4)術(shù)后2周HE染色后病理切片結(jié)果提示冷凍組粘膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)較好,而對(duì)照組上皮細(xì)胞脫落明顯。(5)手術(shù)后2月行順行膀胱尿道造影提示實(shí)驗(yàn)組尿道連續(xù)性以及管徑直徑明顯優(yōu)于對(duì)照組;(6)術(shù)后2月將手術(shù)部位切下后行HE染色,提示冷凍組尿道手術(shù)部位爬覆著一層鱗行上皮,而對(duì)照組因炎癥反應(yīng)劇烈,瘢痕組織較多見(jiàn)。
　　結(jié)