血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植應(yīng)用于兔尿道缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 先天畸形、外傷或腫瘤等疾病致使尿道損傷、狹窄或缺損，都需要進(jìn)行尿道的修復(fù)、重建。盡管目前有300多種尿道修復(fù)的術(shù)式可供選擇，但是術(shù)后尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生率卻依然居高不下。臨床觀察證實(shí)，這些并發(fā)癥的出現(xiàn)幾率與術(shù)后尿道的血供豐富與否成反比。目前大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床資料均表明，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)能幫助改善機(jī)體缺血部位和損傷部位的血供。 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，又稱為成血管

2、細(xì)胞或者血管母細(xì)胞(angioblast)，是干細(xì)胞分化成熟過程中的一個(gè)細(xì)胞階段。研究表明，在臍帶靜脈血、成體外周血和骨髓中的CD34<'+>單個(gè)核細(xì)胞或CD133<'+>單個(gè)核細(xì)胞離體培養(yǎng)均能分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，從而認(rèn)定這些細(xì)胞即為原始的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)人臍帶血、外周血中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)均來自于骨髓。機(jī)體的損傷或缺血可以通過引起內(nèi)源性VEGF的水平升高來動(dòng)員骨髓中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)向靶組織歸巢

3、、分化，而且在向成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)分化、參與靶組織的血管再生過程中對(duì)CD133的表達(dá)逐漸轉(zhuǎn)弱甚至消失。 國內(nèi)外尚未見到有關(guān)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)移植應(yīng)用于尿道缺損修復(fù)方面的文獻(xiàn)報(bào)道。 研究目的： 觀察血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)在尿道缺損修復(fù)術(shù)后改善新尿道組織血液循環(huán)的效果。為減少和避免臨床上尿道缺損修復(fù)術(shù)后尿瘺等并發(fā)癥的出現(xiàn)以及提高一期尿道修復(fù)的成功率提供一個(gè)新的思路。研究

4、方法： 無菌取兔雙下肢骨髓，應(yīng)用密度梯度離心法分離并在體外培養(yǎng)其中單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞，誘導(dǎo)其向血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)方向分化，將細(xì)胞傳至第3代后備用。 人為去除雄性兔尿道中段長約1cm，制作成兔尿道缺損模型。然后應(yīng)用制備好的人脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)修復(fù)尿道缺損。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組中，將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第3代細(xì)胞點(diǎn)狀注射于修復(fù)后的尿道吻合口處及其外層的皮下組織中，對(duì)照組中應(yīng)用等量的空白細(xì)胞培養(yǎng)液處理，術(shù)后按尿道下裂手術(shù)后常規(guī)護(hù)理。然后分別

5、于術(shù)后4 w、12 w切取修復(fù)后的尿道組織，10％福爾馬林固定，石蠟包埋切片后行HE染色，觀察新尿道組織中血管再生情況，并隨機(jī)計(jì)數(shù)100倍光鏡下20個(gè)視野內(nèi)毛細(xì)血管斷面的數(shù)目，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照細(xì)間的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、兔骨髓源單個(gè)核細(xì)胞在體外呈貼壁生長，48 h內(nèi)即貼壁牢靠。前4 d內(nèi)生長較慢，近乎靜止?fàn)顟B(tài)，4 d后生長明顯加速，呈現(xiàn)出克隆樣生長；10 d后細(xì)

6、胞基本長滿瓶底，表現(xiàn)出典型的鋪路石樣改變；經(jīng)VEGF和bFGF在體外聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞表現(xiàn)出條索狀和草束狀的排列方式。細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示，目標(biāo)細(xì)胞對(duì)CD133的表達(dá)水平下調(diào)，由具有CD34<'+>/CDl33<'+>/CD31<'+>表型的細(xì)胞群逐漸分化成具有CD34<'+>/CD133<'->/CD31<'+>表面特征的細(xì)胞群； 2、術(shù)后4 w、12 w分別行尿道組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中毛細(xì)血管數(shù)目明顯多于對(duì)照組。4 w時(shí)