魚類精子脂類分析方法的研究及幾種魚類精子脂類含量的比較.pdf

1、通過對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn),精子細(xì)胞中脂類主要由磷脂、中性脂、糖脂三部分組成,不同物種的精子細(xì)胞脂類組成和含量存在著差異,相同物種的精子細(xì)胞脂類在不同時(shí)期和精子不同部位也存在著差異。脂類對(duì)哺乳動(dòng)物精子存活、成熟、流動(dòng)性和適應(yīng)性等有重要作用,并且脂類成分與精子某些生理功能密切相關(guān),如授精、頂體反應(yīng)和精卵融合等。對(duì)于精子脂類種類和成分的研究多集中在哺乳動(dòng)物,而對(duì)魚類精子脂類的研究相對(duì)較少。因此,對(duì)魚類精子細(xì)胞脂類的研究具有重要意義。
　

2、　 本文研究?jī)?nèi)容主要是,以孔雀魚(Poecilia reticulate)精子為材料,初步建立了魚類精子脂類的提取以及高效液相法檢測(cè)脂類成分和含量的操作流程,運(yùn)用已經(jīng)建立起來的方法對(duì)斑馬魚(Danio rerio)和鱸魚(Lateolabrax iaponicus)精子的脂類成分和含量進(jìn)行了測(cè)定。另外,深入研究了低溫冷凍對(duì)孔雀魚和鱸魚不同脂類含量的影響以及不同活力精子間脂類含量的差異。
　　 本文采用超聲破碎法對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行破

3、碎,然后通過有機(jī)溶劑萃取法(Folch法、Bligh&Dyer法和MTBE法)對(duì)精子脂類進(jìn)行提取。采用氨基固相萃取柱對(duì)所得精子脂類樣品進(jìn)行凈化和初步分離,得到中性脂、脂肪酸和磷脂三種組分。進(jìn)一步采用高效液相色譜層析對(duì)所得中性脂和磷脂組分進(jìn)行了定性和定量分析。對(duì)中性脂組分的分析采用Extend-C18(4.6×250 mm,5μm)反相柱,甲醇作流動(dòng)相等梯度洗脫,流速1 ml/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm；對(duì)磷脂的分析采用Rx

4、-SIL(4.6×250 mm,5μm)正相柱,乙腈-甲醇-磷酸(90:6.3:3.7,V/V/V)作流動(dòng)相等梯度洗脫,流速1.2 ml/min,柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm。結(jié)果成功分離了所提取精子脂質(zhì)的膽固醇(CHO),磷脂包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和神經(jīng)鞘磷脂(SM)。
　　 孔雀魚鮮精中CHO、PE、PC和SM四種脂類的含量分別為:24.24、91.92、230.40和40.89μg/108個(gè)精子；

5、斑馬魚鮮精中四種脂類的含量分別為:12.96、18.85、48.07和4.75μg/108個(gè)精子:鱸魚鮮精中四種脂類的含量分別為:5.35、33.93、58.73和7.53μg/108個(gè)精子。綜合比較孔雀魚、斑馬魚和鱸魚鮮精中CHO、PE、PC和SM的含量,孔雀魚的四種脂類絕對(duì)含量均較高,尤其是PE和PC。其次是鱸魚,斑馬魚的含量最低。就百分含量而言,CHO:斑馬魚>孔雀魚>鱸魚,PE:鱸魚>孔雀魚>斑馬魚,PC:孔雀魚>斑馬魚>鱸魚,

6、SM:孔雀魚>斑馬魚>鱸魚。換句話說,淡水魚(孔雀魚和斑馬魚)精子中CHO、PC和SM的含量高于海水魚(鱸魚),PE低于海水魚。
　　 此外,本文對(duì)不同活力的精子超低溫冷凍保存前后脂類含量的變化進(jìn)行了測(cè)定。超低溫冷凍保存后PE的百分含量降低,PC的百分含量升高,這說明PE和PC在精子對(duì)抗冷凍刺激中可能發(fā)揮了一定的作用。而且經(jīng)過超低溫保存后PE百分含量降低的越多、PC百分含量增加的越多,精子的活力就越高。這種變化可以證明PE百分含