SS2三種毒力相關蛋白的克隆、表達及MRP與EF單克隆抗體的制備.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2，SS2)可以導致豬腦膜炎、關節(jié)炎、敗血癥、漿膜炎、心內膜炎、多發(fā)性關節(jié)炎等，對從業(yè)人員帶來嚴重的威脅，可以導致人的腦膜炎、心內膜炎及中毒性休克綜合癥等嚴重疾患。目前國內外對SS的研究主要集中在SS2毒力相關因子上，目前公認的毒力相關因子有溶菌酶釋放蛋白(muramidase released protein，MRP)、胞外蛋白因子(extracellular factor prote

2、in，EF)、溶血素(suilysin，本文簡稱sly)、莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)等。由于對SS2毒力因子的了解較少限制了SS疫苗的研究及豬鏈球菌病的治療與控制。本試驗對1998年江蘇海安病人分離株Habb MRP進行研究；對2005年四川資陽病人分離株分別進行EF和sly的研究。制備了MRP及EF單克隆抗體，并摸索MRP ELISA檢測方法。克隆及表達SS2人源分離株Habb mrp基因片段，

3、構建原核表達質粒pGEx4T-2-mrp。在大腸桿菌中誘導帶有谷胱甘肽轉移酶(GST)標簽的融合蛋白MRP-GST表達；經親和層析法純化后，用凝血酶酶切去除重組蛋白中的GST，制備純化的MRP抗原。序列分析表明，獲得的mrp基因長957bp；原核表達的融合蛋白MRP-GST的分子量約61kD；凝血酶處理的MRP抗原的分子量約為35kD。Western blot分析顯示，MRP-GST、MRP蛋白均可與MRP多克隆抗血清發(fā)生特異性反應。成

4、功地克隆人源分離株Habb的mrp基因片段，并在原核系統(tǒng)實現(xiàn)高效表達，制備的純化抗原MRP具有良好的抗原性，為開展相關免疫學研究奠定了基礎。 SS2 MRP單克隆抗體的研制及其生物學特性的鑒定。以純化的MRP-GST蛋白為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術進行細胞融合，并以經凝血酶酶切去除GST標簽的MRP篩選細胞，經反復篩選和多次克隆化培養(yǎng)，篩選出特異分泌鼠抗MRP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用Western

5、blot對單抗進行生物學特性的鑒定。成功獲得6株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗MRP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1G1、1B6、2B8、3G9、2C3及3E5。 用表達純化的MRP抗原、HRP標記的MRP抗原和一株MRP單抗腹水、以及ZY05719全菌兔多抗血清及豬多抗血清，建立檢測豬鏈球菌MRP抗原及SS MRP抗體的ELISA方法。SS MRP抗血清的檢測采用純化的MRP抗原或滅活ZY05719細菌包被，加待檢血清，加HRP標記的MRP抗

6、原；檢測細菌MRP采用雙抗體夾心ELISA，兔全菌多抗包被，加待檢細菌裂解液，用HRP標記MRP單抗檢測。檢測抗體的ELISA方法獲得了理想的結果。檢測細菌的雙抗體夾心法，不能很好的檢測MRP，表明標記的2C3單抗不適合于檢測?？寺?、表達SS2四川人源分離株ZYH24 epf因片段，分析蛋白活性。對克隆的ZYH24 epf基因片段進行序列分析；構建原核表達質粒pGEX4T-2-epf,在大腸桿菌中誘導融合蛋白EF-GST的表達；親和層析

7、法純化融合蛋白EF-GST，用凝血酶切除重組蛋白中的GST，獲得純化的EF抗原。蛋白經SDS-PAGE和Western blot分析鑒定。序列分析表明，獲得的epf因片段長895 bp；原核表達的融合蛋白EF-GST分子量約62kD，凝血酶處理后的EF抗原分子量約為35kD，兩者均可與制備的EF多克隆抗血清發(fā)生特異性反應。 SS2 EF單克隆抗體的研制及其生物學特性的鑒定。以表達、純化的EF蛋白為免疫原，以純化的EF蛋白包被的間

8、接ELISA方法反復篩選和多次克隆培養(yǎng)，篩選出特異分泌鼠抗EF蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用Western blot對單抗進行生物學特性的鑒定。成功獲得4株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗EF單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2G1、5H7、3H4及1F2。 05年四川病人腦脊髓液分離株ZYH25，對其sly進行分析，并構建原核表達載體pQE-30-sly，在大腸桿菌中誘導sly基因片段的表達。用滅活ZY05719制備的兔多克隆抗血清，通過