水牛IFN-γ克隆表達及其單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、水牛(Bubalus bubalus,Bb),哺乳綱牛科(Bovidae)水牛屬,適宜于水田耕作。水牛奶質(zhì)十分優(yōu)良,所含蛋白質(zhì)、氨基酸、乳脂、維生素、微量元素等均高于黑白花牛奶,其營養(yǎng)價值相當(dāng)于黑白花牛奶的兩倍,作為一類高級營養(yǎng)食品,水牛奶制品日漸成人們消費的“新寵”,在商業(yè)上具有潛在的巨大的價值。水牛肉,特別是小水牛肉,味香、鮮嫩,且脂肪含量少。另外,水牛角可以入中藥。中國是水牛資源十分豐富的國家,據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計資料,

2、截止2003年,我國水牛飼養(yǎng)量為2275.9萬頭,已上升為世界第三位。
　　 結(jié)核病(Tuberculosis)由結(jié)核分枝桿菌引起的人畜共患病。人接觸患結(jié)核病的水牛或者食用未經(jīng)消毒的患結(jié)核病水牛的奶,會引起人的結(jié)核病。水牛感染結(jié)核病,成為制約奶水牛發(fā)展的潛在威脅。到目前為止,我國水牛結(jié)核病檢疫還沒有一套完整可行的方法,一直是采用黃牛的檢測標(biāo)準(zhǔn)進行檢測,即結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(TST)。TST為法定的黃牛結(jié)核病檢疫方法,應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)檢測

3、水牛結(jié)核病誤差較大,不適合水牛的檢測。因此,尋找一種新型的水牛結(jié)核病檢測方法迫在眉睫。
　　 干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的多種功能的免疫活性蛋白。γ-干擾素(IFN-γ)是Ⅱ型干擾素,IFN-γ體外釋放法是目前檢測結(jié)核病最具有應(yīng)用前景的檢測方法之一,它是在特異性抗IFN-γ單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立的對于待檢樣品中IFN-γ定性定量分析的一種實驗方法。國外學(xué)者已經(jīng)將抗原特異性IFN-γ試驗的應(yīng)用于多種動物疫病的檢測

4、。相對而言,水?？乖禺愋訧FN-γ試驗研究報道較少。
　　 本研究克隆表達并純化了水牛IFN-γ(BbIFN-γ),對其進行了抗病毒活性分析,制備了抗BbIFN-γ單克隆抗體與多克隆抗體,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測BbIFN-γ的雙抗體夾心ELISA方法。
　　 1.水牛IFN-γ的克隆與原核/酵母表達
　　 通過Con A刺激,從水牛全血中提取BbIFN-γ mRNA,根據(jù)GenBank上發(fā)布的廣西沼澤型水牛的I

5、FN-γ mRNA序列設(shè)計引物,擴增出cDNA,克隆到原核表達載體pET-30a,轉(zhuǎn)化BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達出大小為22kD左右的可溶性重組蛋白。
　　 根據(jù)測序結(jié)果,把密碼子改為畢赤酵母偏愛密碼子并全基因合成,亞克隆到酵母穿梭質(zhì)粒pPICZαA,轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)GS115,經(jīng)甲醇誘導(dǎo),表達出18kD左右的蛋白。
　　 2.水牛IFN-γ抗VSV/IBRV病毒活性的鑒定
　　 為了鑒定原核和酵母表達的蛋白是

6、否具有抗病毒活性,檢測了IFN-γ抑制水皰性口炎病毒(VSV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)在牛腎細胞系(MDBK)的增殖能力。結(jié)果顯示,原核表達與酵母表達的兩種蛋白的抗VSV活性分別為2.05×105U/mL和7.44×105U/mL,抗IBRV活性分別為5.22×104U/mL和2.61×105U/mL。所表達的兩種重組BbINF-γ蛋白均具有抗病毒活性,原核表達的蛋白抗IBRV活性比酵母表達的偏低。
　　 3.水牛IF

7、N-γ單,多克隆抗體的制備與鑒定
　　 本研究利用兩種表達蛋白混合免疫Balb/C小鼠,并用兩種蛋白分別篩選雜交瘤細胞株,獲得五株高效價的單克隆抗體,分別命名為1C3、2C3、3E7、4G6、4H4,腹水效價分別為2.56×104、5.12×104、1.28×104、2.56×104、5.12×104。Western blot分析顯示五株單抗均能特異性結(jié)合BbIFN-γ,表明五株單抗均為BbIFN-γ的特異性單抗。間接ELISA

8、表明,McAb不與其他抗原反應(yīng),進一步證實其特異性良好。
　　 利用兩種表達蛋白混合免疫日本大耳白兔,獲得兔高免血清,經(jīng)純化得到多克隆抗體,Western blot分析顯示多抗能特異性結(jié)合BbIFN-γ。
　　 4.雙抗體夾心ELISA方法的建立
　　 用2C3株單抗、多抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG,建立雙抗體夾心ELISA方法,檢測BbIFN-γ,結(jié)果其檢測的靈敏度達到125pg/mL,靈敏度