復方茯苓甘草湯不同煎劑防治大鼠肺動脈高壓的藥效及毒性研究.pdf

1、目的：
　　 通過建立常壓缺氧性肺動脈高壓動物模型,分別以肺動脈高壓、肺血管形態(tài)學、右心指數和動脈血氣的改變?yōu)橹笜?將復方作為一個整體,采用不同的中藥制劑配方組成,將復方水煎液進行動物的藥效學研究,進而確定哪個方案更具臨床療效。然后對該方案進行動物毒性實驗研究,探討該復方的藥物安全性,為進一步的研究就是探討中藥的現代化運用成分研究,賦予傳統(tǒng)的中醫(yī)方藥以現代的科學內涵,為臨床開發(fā)安全有效、質量可控的治療HPH的中藥新藥奠定基礎。<

2、br>　　 方法：
　　 實驗分不同中藥制劑水煎液藥效實驗及復方茯苓甘草湯水煎液對SD大鼠的毒性實驗兩個部分。
　　 1.不同中藥制劑水煎液藥效實驗:照薛全福等[62]的方法并略改動。采用SPF級SD系雄性大鼠50只,體量200~220g,隨機分組分為空白組、對照組、飲片組、免煎組和再煎組,每組10只。大鼠按組別置于缺氧艙內,控制艙內氧濃度在10±0.5％范圍。每天缺氧8小時,連續(xù)缺氧21天。空白組不缺氧,每天予生理鹽

3、水4ml灌胃,其余各組缺氧前每天予藥液4ml灌胃。21天后行右心導管法檢測大鼠平均肺動脈壓(mPAP),然后處死大鼠,取完整右下肺常規(guī)石蠟包埋切片,行HE及Weigert彈性纖維染色,光鏡下觀察并計數肺小血管(15μm＜外徑≤50μm)中肌型動脈(MA)、部分肌型動脈(PMA)和無肌型動脈(NMA)的數目,分別計算占肺小血管總數的百分比。利用圖像分析系統(tǒng)測量肺中小型動脈相對中膜厚度(RMT)及面積(RMA)。并進行肺大皰面積比例的計算,

4、每只大鼠選一相同肺組織橫向切片,每張切片用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)測定肺大皰總面積(SB)、肺組織總面積(SL),計算肺大皰總面積與肺組織總面積的比值(SB/SL)。計算右心肥厚指數[RV/(LV+S)]。心臟采血5ml,裝入抗凝管中,冷藏箱保存,急送檢驗進行動脈血氣分析。檢測相關指標,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析:計量資料用((x)±s)表示,多樣本均數比較用單因素方差分析,先進行方差齊性檢驗,總體方差齊時用Bonfe

5、rroni法,方差不齊時用Tamhane's T2法,P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義,比較不同中藥組分制劑對防治肺動脈高壓療效結果。
　　 2復方茯苓甘草湯水煎液對SD大鼠的毒性實驗:
　　 2.1復方茯苓甘草湯水煎液不同濃度劑量分組:
　　 急性毒性組—因在預實驗中無法測出LD50,故進行了大鼠一天多次灌胃給藥的最大給藥量的測定,結果最大給藥量600g生藥/kg,相當于人用劑量100倍,人用劑量為1g生藥/kg

6、,人體重以60kg計。
　　 高劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以360g生藥/kg混懸液,相當于人用劑量的60倍,濃縮成6g生藥/ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 中劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以180g生藥/kg混懸液,相當于人用劑量的30倍,濃縮成6g生藥/ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 低劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以90g生藥/kg混懸液,相當于人用劑量的15倍,濃縮成6g生藥/

7、ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 2.2動物篩選與驗證SPF級SD系雌雄各半大鼠100只,體重200~220g,隨機分組分為空白組、急性毒性組、高劑量組、中劑量組和低劑量組,每組20只。空白組不給藥,每天予生理鹽水自由飲用,急性毒性組一天5次灌胃,4ml/次,其余三組每天按濃度限量配水飲用。分別于給藥30天后及停藥14天后隨機選取一半大鼠處死,完整剪下心臟、肝臟、腎臟、脾、肺、腎臟、子宮、睪丸、卵巢、附睪、腎上腺,冰鹽水洗凈并經濾

8、紙吸干后,電子天平稱量重量,計算臟器指數[R·(L+S)-1]。各器官取部分組織用福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片,行HE及Weigert彈性纖維染色,光鏡下觀察各組織形態(tài)結構是否異常。心臟采血2ml,裝入抗凝管中,冷藏箱保存,急送血液學檢測。心臟采血3ml,裝入促凝管中,冷藏箱保存,急送生化學檢測。數據分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料數據均采用均數±標準差((x)±s)表示,多組之間比較采用方差分析,以.P＜0.05具有統(tǒng)計學

9、意義。
　　 結果：
　　 1.慢性缺氧21天后,B組大鼠的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值比A組的均明顯升高(P＜0.01),而NMA(%)則明顯降低。右心肥厚,肺小動脈內皮細胞細胞破壞,中膜增厚,外膜炎性細胞浸潤,管壁細胞外基質異常沉積,管腔狹窄,無肌型及部分肌型動脈肌化,顯示慢性缺氧性肺動脈(PAH)高壓大鼠模型成功建立。
　　 2.經治療后C組、D組、E組

10、的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值與B組的比較,均有所下降(P＜0.01),但未能恢復到A組水平(P＜0.01)。另外,C組、D組、E組之間的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW相比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但三組相比較,C組最高,D組次之,E組最低。C組、D組、這兩組的肺小動脈內皮細胞細胞連續(xù)性破壞,中膜平滑肌細胞增生、內外彈力層距離、管壁ECM沉積及外膜炎性細胞浸潤均

11、較B組減輕,肺泡間無肌型動脈肌化現象減少,總體改善以C組最明顯。E組的肺小動脈內皮細胞細胞連續(xù)性受破壞程度較B組輕,但較C組、D組稍重,中膜平滑肌細胞出現增生肥大,內外彈力層距離稍增寬,外膜炎性細胞浸潤,管壁增厚,管腔狹窄或呈不規(guī)則樣,肺泡間無肌型動脈內膜輕度增生肥厚,彈力纖維有增生,并出現平滑肌。
　　 3.可認為中藥飲片水煎液和免煎顆粒水溶液在防治常壓缺氧性PAH大鼠無論是在器質性和功能性效果無明顯差異,而結合經濟及便利性方

12、面的考量,在接下來的復方茯苓甘草湯的毒性實驗里,我們選擇性價比更高的中藥飲片作為實驗藥品。
　　 4.按最大濃度、最大容積給藥,大鼠口服復方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為120g/kg:按一天內多次最大量給藥,口服復方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為600g/kg。給藥1天后,20只大鼠神疲乏力,少氣懶動,扎堆取暖,大便稀溏未見小鼠口、鼻、眼有異常分泌物出現。第14天,20只大鼠與別組大鼠狀況無明顯差異,一般狀況良好,活動

13、、食量正常,無死亡情況。
　　 5.大鼠連續(xù)給藥復方茯苓甘草湯30d后,Ⅲ組白細胞計數與Ⅰ組相比有差異性(0.01＜P＜0.05),Ⅳ組、Ⅴ組兩個劑量組的AST值升高,與Ⅰ組相比具有差異性高(P＜0.01),停藥后1天,將受試動物隨機選取一半處死,取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等經肉眼觀察,外觀、形態(tài)、大小及顏色均正常,未發(fā)現充血、腫脹及壞死等異?，F象;給藥組動物的臟器系數與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),將上述組織器官經

14、病理組織學檢查,亦未見組織萎縮、增生、炎細胞浸潤及細胞退行性變等明顯病理變化及與中毒有關的病理性改變。
　　 6.停藥14d后,大鼠攝食量、體重、行為活動、血象和重要器官臟器系數均正常;病理學檢查,各組各臟器均未發(fā)現明顯變化。
　　 結論：
　　 1.復方茯苓甘草湯的中藥飲片水煎液、免煎顆粒水溶液、免煎顆粒再煎液對防治常壓缺氧性PAH大鼠模型都是有效的。而三者相比較起來,中藥飲片水煎液、免煎顆粒水溶液的效果較免煎

15、顆粒再煎液更為明確。
　　 2.復方茯苓甘草湯中各成分的中藥飲片及免煎顆粒的療效無明顯差異性,這六種中藥的飲片制劑及免煎制劑的一次煎煮效果接近,而免煎顆粒在水溶解后再煎煮對肺動脈高壓的療效略遜于首次溶解。
　　 3.復方茯苓甘草湯可采用免煎顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的中藥飲片。
　　 4.按最大濃度、最大容積給藥,大鼠口服復方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為120g/kg:按一天內多次最大量給藥,口服復方茯苓甘草湯中藥飲片水

16、煎液的MTD為600g/kg。
　　 5.大鼠連續(xù)給藥30d后,Ⅲ組白細胞計數升高為過量用藥后反應的一過性升高。Ⅴ組的AST顯著升高原因為心臟取血時人為因素地產生額外手術創(chuàng)傷,因AST的敏感性較ALT高。而Ⅳ組前后AST升高無顯著差異性,但ALT與Ⅰ組無明顯差異性(P＞0.05)。給藥組動物的臟器系數與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),提示復方茯苓甘草湯長期給藥對動物主要器官的生長發(fā)育無明顯影響。
　　 6.停藥1