煙草根系鉀通道基因NTORK1的功能及調(diào)控研究.pdf

1、為研究煙草鉀通道基因NTORK1是否受激素調(diào)控，參與調(diào)節(jié)根系的鉀外流，利用pBI121和pER8（含XVE系統(tǒng)）為骨架載體，分別構(gòu)建了NTORK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)載體和受ES誘導(dǎo)啟動(dòng)NTORK1的RNAi表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，分別研究了NTORK1啟動(dòng)子和NTORK1基因的功能。獲得的結(jié)果如下：
　　1、使用不同濃度 SA和 NAA處理低鉀 Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)的煙草 K326植株，然后檢測(cè)植

2、株根外鉀離子含量變化，同時(shí)使用Real-time PCR分析NTORK1基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，50μmol/L SA能抑制根鉀離子外流；500μmol/L SA能誘導(dǎo)根鉀離子外流，并誘導(dǎo)NTORK1基因的表達(dá)。
　　2、構(gòu)建了 NTORK-GUS表達(dá)載體。以 pBI121載體為基礎(chǔ)，克隆 NTORK1基因上游2111bp片段替換原載體上的35S啟動(dòng)子。構(gòu)建了NTORK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)載體pBI121-NTORK。

3、r>　　3、通過煙葉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化pBI121-NTORK表達(dá)載體和不同激素處理。結(jié)果顯示， NTORK啟動(dòng)子受5.4μmol/LNAA和500μmol/LSA的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　4、構(gòu)建了NTORK1的RNAi表達(dá)載體。以pER8載體為基礎(chǔ)，在多克隆位點(diǎn)插入NTORK1基因的RNAi片段、Tnos終止子、DR5啟動(dòng)子和GUS。其中RNAi片段來自NTORK1基因3’端250bp片段和actin內(nèi)含子。
　　5、通過葉盤穩(wěn)定轉(zhuǎn)化NT

4、ORK1的RNAi表達(dá)載體，獲得大量潮霉素抗性苗。經(jīng)PCR鑒定獲得多株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。使用5μmol/L17-β-雌二醇（Es）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株，Real-time PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草NTORK1的表達(dá)被抑制，抑制率最高達(dá)到90％。
　　6、使用含5μmol/L17-β-雌二醇的低鉀Hoagland培養(yǎng)液對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草水培3d。然后在分別含5μmol/L Es、5μmol/L Es+50μmol/L SA、5μmol/L

5、 Es+500μmol/L SA的無(wú)鉀Hoagland培養(yǎng)液中各處理40min。通過檢測(cè)培養(yǎng)液的鉀離子濃度，以及葉片NTORK1基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在Es+500μmol/L SA培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的NTORK1表達(dá)量比在Es+50μmol/L SA處理中增加，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)液鉀離子含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。以上說明， NTORK1受SA調(diào)控，介導(dǎo)煙草根系的鉀離子外流，500μmol/L的SA能誘導(dǎo)NTORK1表達(dá)