煙草MAPK基因的功能研究.pdf

1、煙草是重要的科研模式生物和經(jīng)濟作物。對煙草抗病相關(guān)基因的研究不僅可以幫助我們認識到植物對病蟲害侵染的防御機制，還有助于減少病蟲害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的損失。植物絲裂源活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)反應(yīng)是植物細胞內(nèi)多條應(yīng)答外源刺激信號通路的節(jié)點，其在植物的抗病抗逆和生長發(fā)育中扮演著重要的角色。然而對該基因家族在煙草中的研究并不完善。本論文以煙草MAPK基因為研究對象，重點闡述其在分類、

2、進化、抗病功能及分子機制方面的研究內(nèi)容。本研究的主要結(jié)果如下：
　?、倮靡呀?jīng)公布的煙草數(shù)據(jù)，如煙草甲基化基因組測序數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)等，設(shè)計引物從煙草cDNA文庫中克隆和鑒定得到17個MAPK基因家族成員，其中11個基因是首次鑒定。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，煙草中的 MAPK成員與其他物種的MAPK基因，如擬南芥、水稻、楊樹和葡萄，可以一同聚為6類，且物種間存在潛在的直系同源關(guān)系。氨基酸多序列比對顯示，這17個基因具有MAPK家族成員特有

3、的11個保守結(jié)構(gòu)域和TXY／MEY基序，且序列間十分保守。
　?、谟捎贛APK基因在植物的抗逆和抗病反應(yīng)中具有重要作用，我們調(diào)查了煙草MAPK基因在外源刺激如水楊酸、茉莉酸和干旱處理下的轉(zhuǎn)錄水平表達情況。qRT-PCR分析表明，共有9個煙草MAPK基因的表達受到水楊酸的調(diào)控，11個基因的表達受到茉莉酸的調(diào)控，以及6個MAPK基因受到干旱脅迫的調(diào)控。這些結(jié)果說明煙草的MAPK基因在植物的抗逆抗病方面可能具有重要作用。
　?、劾?/p>

4、用已經(jīng)公布的茄科植物基因組數(shù)據(jù)，鑒定番茄、土豆、茄子和辣椒的MAPK基因家族成員。連同煙草和外群擬南芥的MAPK基因，共同研究該基因家族在茄科植物中的進化歷史?；驍?shù)目分析表明，植物中的MAPK基因在數(shù)目上比較保守，大約都在20個左右。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，該基因家族存在基因的擴增和缺失現(xiàn)象。此外，通過對基因結(jié)構(gòu)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，盡管編碼區(qū)結(jié)構(gòu)保守，但該家族基因的內(nèi)含子數(shù)目和長度卻存在差異。分子進化分析顯示，絕大多數(shù)MAPK基因Ka/Ks<1，然

5、而仍然有一些MAPK（如MKA1、MKA8和MKB1）基因間的Ka和Ks比值大于1，暗示著這些基因可能存在正向選擇的跡象。
　?、苓x取煙草NtMPK2基因作為研究對象。首先調(diào)查了NtMPK2的基因結(jié)構(gòu)和啟動子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子具有多個抗逆抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，暗示該基因可能參與植物抗病抗逆相關(guān)功能。對該基因不同的組織時期表達情況進行qRT-PCR分析顯示，該基因主要在植物的葉片和花中表達，暗示其在這兩個組織中行使功能。

6、然后構(gòu)建了35S:NtMPK2超表達載體，并將該基因利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入煙草基因組中。得到煙草轉(zhuǎn)基因株系后，從基因組水平、RNA水平以及抗生素篩選的方法鑒定得到多株轉(zhuǎn)基因陽性植株。
　?、輰σ吧蜔煵莺蚇tMPK2轉(zhuǎn)基因陽性植株施以有毒病原菌Pst DC3000的侵染。病理分析結(jié)果顯示，野生型煙草在受到病原菌侵染后表現(xiàn)為葉片發(fā)黃等明顯的染病癥狀，然而三株煙草 NtMPK2轉(zhuǎn)基因株系則表現(xiàn)出了輕微染病或不染病的癥狀。對接種后野生型和

7、轉(zhuǎn)基因煙草葉片病原菌的菌落數(shù)目進行了統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在接種24小時后，野生型煙草葉片菌落的數(shù)目明顯高于三個轉(zhuǎn)基因株系。上述結(jié)果表明NtMPK2轉(zhuǎn)基因賦予了煙草對有毒菌株P(guān)st DC3000的抗病能力。為了進一步了解NtMPK2的抗病能力，選取了可以引起植物超敏反應(yīng)的Pst DC3000無毒菌株，對野生型和NtMPK2轉(zhuǎn)基因煙草施以接種，并統(tǒng)計侵染該病原菌0、12、24、36和48小時后葉片中含有的菌落數(shù)目。結(jié)果顯示接種24小時后，野生型

8、煙草含有的菌落數(shù)目明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草。然而接種36小時后，兩者的菌落數(shù)目都出現(xiàn)了居高不下的現(xiàn)象。直到接種48小時后，轉(zhuǎn)基因型煙草菌落數(shù)目明顯高于野生型。這一結(jié)果暗示著煙草可能具有多種途徑用于防御Pst DC3000無毒病原菌的侵染。
　?、逓榱颂剿鳠煵輰st DC3000無毒病原菌的應(yīng)答機制和NtMPK2介導的抗病反應(yīng)，我們選取四個樣本（野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草、侵染Pst DC3000無毒菌株后的野生煙草和轉(zhuǎn)基因煙草）提取RNA

9、，并用RNA-seq的方法獲得其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并對其進行 de novo組裝。組裝分析共得到215,050條 Contigs和152,824個Unigenes。我們又利用測序的reads計算每個樣本基因的表達量，并比較樣品間基因的差異表達，從而鑒定出1,325個受到病原Pst DC300調(diào)控的基因和32個受到NtMPK2影響的基因。對1,325個受到病原Pst DC300調(diào)控的基因進行功能注釋，GO分類結(jié)果顯示這些差異表達的基因功能分布十分

10、廣泛，主要集中在結(jié)合、催化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、酶調(diào)節(jié)子、代謝過程、細胞過程、生物調(diào)節(jié)過程、轉(zhuǎn)運蛋白和應(yīng)答刺激反應(yīng)等多種功能。進一步探索這些差異表達基因的功能顯示，多條信號通路參與到了煙草對Pst DC3000的防御反應(yīng)。這些通路包括水楊酸通路、茉莉酸通路、乙烯通路以及次級代謝產(chǎn)物的生物合成等。對受 NtMPK2影響的差異表達基因進行功能分析顯示，這些基因包括富含甘氨酸的細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白、脫落酸與環(huán)境壓力誘導蛋白TAS14、天冬酰胺合成酶、GDS