保腎1號巴布劑治療慢性腎衰竭腎陽虛證的機理研究.pdf

1、目的：
　　 在前期臨床研究的基礎上開展實驗研究：用CRF腎陽虛證大鼠模型，從大鼠一般情況、腎功能、性激素、血液動力學、腎性貧血、腎臟病理等方面，研究穴位敷貼治療CRF腎陽虛證的作用機理；填補穴位敷貼治療腎病實驗研究的空白。
　　 方法：
　　 研究對象：體重200±20g成年健康SD雄鼠共84只，隨機分7組。空白對照組12只，另72只腺嘌呤灌胃制作慢性腎衰竭腎陽虛證大鼠模型。模型對照組、尿毒清顆粒組、敷貼非穴位

2、組和綜合治療組A、B、C進行實驗研究。
　　 (1).保腎1號巴布劑的制備：
　　 保腎1號巴布劑是按由附子、肉桂、細辛、丁香、花椒、穿山龍、生姜等組成按一定比例混合碾粉。經(jīng)工藝流程制成浸膏后，按一定比例加入事先配制的巴布劑基質(主要成份明膠、甘油、聚丙烯酸鈉等)中，并加入0.5％的促滲劑——氮酮、一定比例的乳化劑及防腐劑等，充分溶合，均勻涂布于無紡布上，覆蓋聚乙烯薄膜，切成0.5cm×0.5cm的方塊，密封包裝，陰涼處

3、儲存?zhèn)溆?。每片巴布劑中的中藥含量，以臨床成人(按60Kg算)常用量，并按體表面積折算法換算：分別制成高劑量組(每片含中藥復方制劑6g)，中劑量組(每片含中藥復方制劑3g)，低劑量組(每片含中藥復方制劑1.5g)備用。由湖北省中醫(yī)院腎病科及藥劑科制備。
　　 (2).實驗方法：
　　 造模：體重200±20g成年健康SD雄鼠共84只，空白對照組12只，另72只腺嘌呤灌胃制作慢性腎衰竭腎陽虛證大鼠模型。按200mg/此·d劑

4、量將腺嘌呤制成混懸液1ml，定時給大鼠腺嘌呤灌胃喂藥，累計總劑量1.5g/只，造模全過程24d。第1～12d，每日給藥1次，第12d以后隔日給藥。于第25d剪尾取血，測BUN、Scr、UA、T，證實造模成功。
　　 分組：隨機分7組，空白對照組、模型對照組、尿毒清顆粒組、敷貼非穴位組和綜合治療組A、B、C進行實驗研究。空白對照組(12只)：僅予假敷貼法。模型對照組(12只)：造模+假敷貼法。尿毒清顆粒組(12只)：造模+尿毒清顆

5、粒治療。敷貼非穴位組(12只)：造模+尿毒清顆粒治療+敷貼非穴位法(使用低劑量敷貼給藥)。綜合治療組(36只)：造模+尿毒清顆粒治療+穴位敷貼法。綜合治療組A(12只)：使用高劑量敷貼給藥。綜合治療組B(12只)：使用中劑量敷貼給藥。綜合治療組C(12只)：使用低劑量敷貼給藥。
　　 上述治療療程均為30天。
　　 ①敷貼法：穴位敷貼法：參考文獻取大鼠命門、雙腎俞穴(考慮大鼠解剖結構不適合做肢體穴位敷貼，故棄用復溜穴)，

6、用10％Na2S將敷貼組大鼠穴位及周邊皮膚脫毛3cm×5cm面積，并予保腎1號巴布劑敷貼于穴位處，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時間均達6～8h，每天敷貼1次，10天一個療程，三個療程共計30天。同時分別取高、中、低三個劑量的保腎1號巴布劑敷貼。
　　 ②假敷貼法：取穴與脫毛的步驟同上，僅使用基質敷貼穴位，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時間均達6～8h，每天敷貼1次，連續(xù)敷

7、貼30天。
　　 ③敷貼非穴位法：取大鼠腹部皮膚，按上述辦法脫毛后，敷貼低劑量保腎1號巴布劑，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時間均達6～8h，每天敷貼1次，連續(xù)敷貼30天。
　　 注意：用大塊膠布將藥物或基質敷貼固定于穴位處；敷貼期間將大鼠分開飼養(yǎng)，防止大鼠互相撕咬導致膠布脫落；每次敷貼均達6h。
　　 ④尿毒清顆粒治療：按2g/kg·d劑量尿毒清顆粒制成混懸液1ml，定時給慢性腎衰竭

8、腎陽虛證大鼠灌胃喂藥，從敷貼日第一天起，共30d。
　　 (3).標本采集及處理：
　　 ①血漿：造模成功后并敷貼前、末次敷貼后當天，應用股靜脈插管取血法壩0量BUN、Scr、UA、T、RBC、HB、N0。
　　 ②腎組織：造模成功后并敷貼前、末次敷貼后當天，每組隨機取2只，迅速處死摘除左腎，從腎皮質向髓質垂直取材，以戊二醛、多聚甲醛混合液作預固定，其后以1％四氧化餓固定，進一步處理，用光鏡觀察。
　　

9、光鏡：在切片機下進行3um切片，HE染色，觀察。
　　 (4).觀察檢測：
　　 ①日常觀察：包括大鼠的飲食、飲水、體重、大小便、皮毛、活動情況、精神狀態(tài)等情況。重點觀察大鼠多尿，多飲，精神萎靡，食少，體重減輕，毛色干枯，耳廓蒼白，目色淡紅，瞇眼，眼瞼浮腫，尾巴濕冷，活動度減少，豎毛，蜷縮，多尿，外陰周圍潮濕等腎陽虛證表現(xiàn)。
　　 ②腎功能檢測：全自動生化分析儀檢測檢測血清尿素氮(blood ureanitrog

10、en，BUN)、血肌酐(serum creat inine，Scr)、尿酸(ur ic acid，UA)。
　　 ③血漿睪酮(T)含量：采用酶標免疫法檢測。取血1m1，肝素抗凝，離心出血漿，血漿睪酮(T)的測定方法按試劑盒說明書進行操作。
　　 ④血液學指標：全自動血液分析儀檢測血紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HB)。
　　 ⑤血液動力學：血清一氧化氮(N0)采用硝酸還原酶法。
　　 血漿一氧化氮濃度檢測：

11、清晨空腹采血，取1mL置肝素抗凝管，1000r/min離心10min，分離后的血漿-70°保存，硝酸還原酶法測定血漿一氧化氮濃度。利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過顯色深淺測定其濃度高低?？瞻坠苤屑尤腚p蒸水0.1mL，標準管中加入100μmo1/L標準應用液0.1mL，測定管加入標本0.1mL，上述3管中均加入0.2mL試劑Ⅰ和0.2mL試劑Ⅱ，混勻，37℃準確水浴60min。然后上述3管中均加入0.2mL試劑Ⅲ和0.1

12、mL試劑Ⅳ，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min，3500～4000r/min離心10min，取上清顯色。血漿一氧化氮含量=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×100μmo1/L。
　　 ⑥腎臟超微結構：將留取的大鼠腎臟，從腎皮質向髓質垂直取材，立即以戊二醛、多聚甲醛混合液作預固定，其后以1％四氧化餓固定，進一步處理，用光鏡觀察。
　　 光鏡：已固定的腎組織標本，經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，在切片

13、機下進行3um切片，HE染色，觀察。
　　 結果：
　　 綜合治療A、B、C組可改善大鼠慢性腎功能衰竭的生存狀態(tài)和組織病理變化，且綜合治療A組較優(yōu)。綜合治療A、B、C組在治療前后腎功能對比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，綜合治療A、B、C組在治療前后T、NO對比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。尿毒清組和非穴位敷貼組治療前后腎功能、T、NO對比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。綜合治療A、B、C組治療后與尿毒清組及非穴位敷貼組腎功