環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測轉crylA基因抗蟲水稻、棉花的研究.pdf

1、自上世紀80年代以來，轉基因技術經歷了迅猛的發(fā)展，給人們帶來了很大的便利，現在已有許多的轉基因作物進入了我們的日常生活。轉基因作物具有產量高、抗逆性好、品質優(yōu)良等特點，但關于轉基因食品的安全性、生態(tài)安全等問題也一直備受關注。許多國家已經出臺了相應的法律法規(guī)對轉基因作物及其衍生產品進行標識管理，因此這就迫切需要合適的檢測手段對轉基因食品進行監(jiān)控。
　　 環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal ampl

2、ification，LAMP)是日本榮研株式會發(fā)明的一種核酸擴增技術，與PCR技術相比具有操作簡單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點。它是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件65℃左右下進行擴增，可在1h內將靶基因片段擴增109～1010倍，因而具有很高的靈敏度和特異性。
　　 本論文建立了用環(huán)介導等溫擴增法檢測轉cry1A基因抗蟲水稻和抗蟲棉花的方法。本

3、研究根據郭三堆專利中轉基因植物(專利申請?zhí)?5119563.8，公開號為CN1134981A)所應用的人工合成的殺蟲蛋白質融合基因（cry1A基因）序列，利用LAMP引物在線設計軟件設計引物，并對鎂離子濃度、dNTPs濃度、反應溫度、內外引物比、Bst DNA聚合酶濃度等條件進行優(yōu)化，建立LAMP檢測轉基因水稻和轉基因棉花的最佳反應體系。
　　 LAMP檢測轉基因水稻25μL反應體系如下:LAMP反應上、下游外引物F3、B3濃度

4、均為0.5 mmol/L;上、下游內引物FIP、BIP濃度均為3.0 mmol/L;其他反應組分終濃度分別為:2.5μL Bst DNA聚合酶緩沖液(20 mM Tris-HC1(pH8.8，25℃)，10mM KCl,10 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4,0.1％ Triton X-100），Mg2+濃度0.5mmol/L，dNTPs濃度為6.0 mmol/L，8 UBst DNA聚合酶大片段的添加量為0.7μL，模板D

5、NA濃度為50 ng/μL;反應條件為65℃恒溫反應60 min，80℃2 min使酶滅活。檢測轉基因棉花的LAMP25μL反應體系為:Mg2+濃度為1.0 mmol/L，dNTPs濃度為5.0 mmol/L，其它與檢測水稻的反應體系及反應條件一致。LAMP反應產物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統觀察結果，產生預期的梯形條帶。
　　 采用CTAB法制備DNA模板進行PCR和LAMP反應，其方法的檢出限分別為0.1％和0

6、.01％，LAMP方法的檢出限是PCR的10倍。另外，對3種非轉基因水稻、3種棉花、2種非轉基因大豆、2種非轉基因番茄及3種含cry1Ac基因的陽性Bt菌株分別進行了PCR反應和LAMP反應來驗證引物的特異性，PCR和LAMP反應結果是一致的，轉基因棉花魯棉17為陽性，其他兩種非轉基因棉花也為陽性，可能是在田間以被污染，其他樣品均為陰性結果，說明建立的LAMP方法具有很好的特異性。
　　 LAMP擴增反應可在60 min內完成，

7、對轉基因水稻和轉基因棉花檢測的整個過程(包括DNA提取60 min、LAMP反應60min和電泳30 min)可在2.5 h內完成，比傳統PCR檢測方法時間縮短一倍，且儀器要求簡單。如在LAMP反應結束后在反應管中加入SYBR GreenⅠ熒光染料，通過混合液的顏色可直接判斷擴增是否發(fā)生，整個檢測可在2h內完成，建立了轉基因水稻和轉基因棉花的LAMP檢測方法。
　　 總之，本研究建立的LAMP檢測抗蟲轉cry1A水稻、棉花技術，