促覺醒肽orexin-A和穩(wěn)態(tài)因子腺苷調節(jié)大鼠內嗅皮層淺層主要神經元興奮性及其機制研究.pdf

1、內嗅皮層(entorhinal cortex,EC)被認為是海馬與其它皮層之間纖維聯(lián)系的門戶,其淺層的主要神經元--星形神經元和錐體神經元接受皮層的纖維投射并通過不同的路徑向海馬傳遞信息,Ⅱ層星形神經元的軸突形成穿通路支配海馬齒狀回和CA3區(qū),而Ⅲ層錐體神經元通過TA通路與海馬CA1區(qū)和下托的錐體神經元的遠端樹突形成突觸聯(lián)系。EC不僅在新皮層一海馬一新皮層記憶環(huán)路中處于重要解剖位置,還與空間學習記憶的形成和鞏固密切相關。眾所周知,認知功

2、能的完成依賴于良好的覺醒狀態(tài)。促覺醒肽orexins(又稱hypocretins)是由外側下丘腦區(qū)特定神經元亞群分泌的一類小分子神經肽。Orexin系統(tǒng)包括來源于同一前體分子的兩個單體orexin-A和orexin-B以及兩種特異的G-蛋白偶聯(lián)受體orexin受體1(orexin receptor1,OX1R)和orexin受體2(orexin receptor2,OX2R)。Orexins在中樞神經系統(tǒng)(central nervous

3、 system,CNS)具有廣泛的興奮作用,通過不同的離子信號機制和突觸機制調節(jié)多個腦區(qū)不同類型神經元的興奮性,進而影響相關腦區(qū)功能。腺苷是CNS內的一種能量代謝產物,隨著神經元活動的增加而逐漸在腦內積聚。與orexins的作用相反,腺苷在CNS中具有廣泛的抑制作用。我們推測正常覺醒狀態(tài)下EC認知功能的維持和延長覺醒狀態(tài)下:EC認知功能的下降與EC的orexins和腺苷水平及其對EC神經元興奮性的調節(jié)作用密切相關,但目前尚無文獻報道。<

4、br>　　 本實驗采用全細胞腦片膜片鉗記錄技術,選擇ECⅡ-Ⅲ層主要神經元(星形神經元和錐體神經元)為研究對象,首先觀察促覺醒肽orexin-A對EC淺層主要神經元的興奮性調節(jié)效應,然后進一步探討其發(fā)揮作用的可能離子通道機制、信號通路機制和突觸機制,最后再初步分析穩(wěn)態(tài)因子腺苷對EC淺層主要神經元的興奮性調節(jié)作用。結果如下:
　　 1.Orexin-A通過抑制持續(xù)K+通道同時激活非選擇性陽離子通道突觸后興奮EC淺層主要神經元

5、r>　　 在灌流的ACSF中加入1μMTTX和5 mM的4-AP分別阻斷電壓門控Na+通道和瞬時K+通道,電壓鉗模式下,給與細胞躍階電壓刺激(-60 mV～+40 mV,+20 mV,step,0.5 s)分離出持續(xù)K+電流,應用orexin-A后記錄神經元的持續(xù)K+電流明顯減小(n=8)。上述結果表明:orexin-A抑制EC淺層主要神經元的持續(xù)K+通道提高其興奮性。
　　 在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻斷電壓門控N

6、a+通道,電壓鉗模式下,先將記錄神經元鉗制在-100 mV,持續(xù)0.5 s,再給與記錄神經元慢電壓ramp刺激[-100 mV～0 mV(10 s)],應用100 nM orexin-A后誘發(fā)出差異電流(n=6)。Orexin-A誘發(fā)電流的平均值在檢測電壓范圍內成一條直線(r2=0.99),表明通道的激活不是電壓依賴的,并且其平均反轉電位為-41.8±4.8 mV,這正符合非選擇性陽離子電流激活的特點。結果提示:orexin-A激活EC

7、淺層主要神經元的非選擇性陽離子通道。
　　 另外,我們還檢測了orexin-A對超極化激活的陽離子通道、G-蛋白偶聯(lián)內向整流K+通道、電壓門控Ca2+通道和生電性Na+/Ca2+交換泵的影響,均為陰性結果。
　　 2.Orexin-A激活OX1Rs通過PKC信號通路發(fā)揮突觸后興奮效應
　　 灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻斷OX1Rs,在電流鉗模式下,給與100 nMorexin-A1～2 min,

8、orexin-A誘發(fā)神經元膜電位去極化的作用消失。結果表明,在ECorexin-A的興奮效應是通過OX1Rs來發(fā)揮的。
　　 將腦片在含1μM BIS-Ⅱ的ACSF中至少孵育2 h,并對BIS-Ⅱ采取長時間循環(huán)灌流給藥。結果顯示:在BIS-Ⅱ存在的情況下,orexin-A去極化神經元的作用消失,并且orexin-A抑制持續(xù)K+電流(n=8)和激活非選擇性陽離子電流(n=9)的效應也消失。結果表明:PKC信號通路參與了orexin

9、-A興奮EC淺層主要神經元的作用。
　　 3.Orexin-A通過OX1Rs增強EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞
　　 在灌流ACSF中分別加入10μM荷包牡丹堿阻斷離子通道型GABAA受體,或者10μM CNQX和50μM AP-V阻斷離子通道型谷氨酸受體,在電壓鉗模式下,將記錄神經元鉗制在-60 mV分離出sEPSCs和sIPSCs,100 nM orexin-A明顯增加sEPSCs頻率(對照的202±56％;n=29

10、;P＜0.001;K-S檢驗)和幅度(對照的138±29％;n=29;P＜0.001;K-S檢驗),也能增加sIPSCs的頻率(對照的199±45％;n=22;P＜0.001;K-S檢驗)和幅度(對照的114±11％;n=22;P＜0.001;K-S檢驗)。上述結果說明,orexin-A可同時增強EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞。
　　 在上述實驗條件的基礎上,在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻斷電壓門控Na+通道,將記錄神經

11、元鉗制在-60 mV分離出mEPSCs和mIPSCs,100 nM orexin-A明顯增加mEPSCs頻率(p＜0.001,n=6,K-S檢驗)和幅度(p＜0.001,n=6,K-S檢驗),也能增加mIPSCs的頻率(p＜0.001,n=5,K-S檢驗)和幅度(p＜0.001,n=5,K-S檢驗)。上述結果表明:orexin-A既通過突觸前效應又通過突觸后效應影響突觸傳遞。
　　 灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻

12、斷OXR1s,100 nM orexin-A增加mEPSCs和mIPSCs的頻率(mEPSCs:P=0.17,n=6,K-S檢驗;mIPSCs:P=0.14,n=5,K-S檢驗)和幅度(mEPSCs-P=0.22,n=6,K-S檢驗;mIPSCs:P=0.10,n=5,K-S檢驗)的效應消失,結果提示OX1Rs介導orexin-A增強突觸傳遞的效應。
　　 4.Orexin-A誘發(fā)突觸后NMDA受體上調
　　 本實驗采用

13、無Mg2+ACSF,在電壓鉗模式下,將記錄細胞鉗制在,60 mV。選用NMDA受體選擇性激動劑NMDA(100μM)作用于EC淺層主要神經元可誘發(fā)出內向電流,電流幅值平均為824.9±163.7 pA(n=7)。此電流可完全被不可逆NMDA受體特異性拮抗劑MK-801(10μM)所阻斷。然后通過灌流方式給與100 nM orexin-A15～30min,在這期間浴槽中的MK-801被置換掉,再次應用100μM NMDA后又可誘發(fā)出NMD

14、A受體介導的內向電流(41.5±26.3 pA,n=7)。上述結果提示:orexin-A能夠使胞漿內的NMDA受體轉移到胞膜上。
　　 5.腺苷激活腺苷A1受體降低EC淺層主要神經元興奮性
　　 在電壓鉗模式下,通過將神經元鉗制在-40 mV水平來誘發(fā)其放電,給與100μM腺苷后放電頻率逐漸減慢直至放電停止,沖洗后可恢復(n=31)。另外,在靜息電位水平下,腺苷使固定電流強度刺激下動作電位發(fā)放數(shù)目顯著減少(加藥前:5.5

15、±1.4個;腺苷:2.4±1.3個;沖洗后:5.2±1.3個;n=16;P＜0.001)。接下來,在電流鉗模式下,腺苷能夠誘發(fā)神經元膜電位超極化,并且超極化幅度具有劑量依賴性的特點,50、100和200μM腺苷引起的平均超極化幅度分別為1.5±0.3(n=6)、2.8±0.5(n=20)、4.4±0.6 mV(n=12)。腺苷A1受體拮抗劑DPCPX(3μM)能夠阻斷腺苷的抑制效應,腺苷A2受體拮抗劑DMPX(10μM)卻不能。另外,H

16、CN通道激活劑8-Br-cAMP減弱腺苷的超極化效應,HCN通道阻斷劑ZD-7288阻斷腺苷的超極化效應。上述結果表明:腺苷激活腺苷A1受體通過關閉HCN通道降低EC淺層主要神經元興奮性。
　　 綜上所述,本實驗研究結果表明:第一,orexin-A作用于突觸后OX1Rs激活PKC信號通路通過抑制持續(xù)K+通道同時激活NSCC提高EC淺層主要神經元興奮性;第二,orexin-A通過激活OX1Rs增強EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞;第