Orexin-A興奮大鼠皮層神經(jīng)元的細胞機制.pdf

1、Orexins，即hypocretins，是1998年分別被兩個研究組同時發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，orexin神經(jīng)元主要位于外側(cè)下丘腦和穹隆區(qū)。Orexin系統(tǒng)包括來自同一前體物質(zhì)的二個單體orexin-A和orexin-B(ORX-A和ORX-B)。Orexins主要是通過活化兩個G蛋白偶聯(lián)受體OX1R和OX2R發(fā)揮作用。大量研究已經(jīng)表明，orexins在促進覺醒中發(fā)揮非常重要的作用，這種促覺醒作用主要是通過興奮多個皮層下覺醒系統(tǒng)，包括藍斑

2、去甲腎上腺素能神經(jīng)元、結(jié)節(jié)乳頭體組胺能神經(jīng)元、中腦腦橋和基底前腦膽堿能神經(jīng)元和非特異性丘腦皮層投射系統(tǒng)等。先前本室的研究發(fā)現(xiàn)，ORX-A可直接興奮大鼠前額葉皮層(prefrontalcortex，PFC)錐體神經(jīng)元，并呈劑量依賴性。這些研究結(jié)果表明orexin系統(tǒng)除了通過間接的皮層下覺醒通路外，還可通過直接的下丘腦皮層通路參與對覺醒的調(diào)控。Orexins興奮神經(jīng)元和非神經(jīng)元的機制研究現(xiàn)在已受到越來越多的關(guān)注。大量的研究結(jié)果已經(jīng)表明，or

3、exins在不同腦區(qū)和不同核團是通過活化不同信號通路引起多種離子機制發(fā)揮興奮作用的。然而，關(guān)于orexins興奮皮層神經(jīng)元的機制，尤其是胞內(nèi)信號通路還鮮有報道。 此外，許多研究表明orexin受體激活另一主要表現(xiàn)為胞內(nèi)鈣增加。Orexins既可通過胞外鈣內(nèi)流又可通過胞內(nèi)鈣庫釋放或二者共同參與增加胞內(nèi)鈣水平。盡管已有研究表明orexins可增加皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣，但究竟是來自胞外鈣內(nèi)流還是胞內(nèi)鈣庫釋放仍需進一步研究。 本

4、研究旨在通過膜片鉗技術(shù)和鈣成像技術(shù)對ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的機制進行深入研究。首先，以急性分離的Wistar大鼠PFC錐體神經(jīng)元為研究對象，采用全細胞膜片鉗技術(shù)并結(jié)合藥理學方法，觀察ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的細胞機制。同時，在鈣成像中，采用新型鈣指示劑fluo-4/AM負載細胞，觀察ORX-A對原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和急性分離的PFC錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣的影響及其作用機制。 1.G蛋白參與ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元

5、 電流鉗記錄顯示，ORX-A(10-5M)可使PFC錐體神經(jīng)元膜去極化和動作電位發(fā)放頻率增加。電極內(nèi)液加入0.5mMGDP-β-S(GDP阻斷劑，可抑制G蛋白介導的胞內(nèi)信號)時，ORX-A不能引起皮層錐體神經(jīng)元發(fā)生任何興奮反應(yīng)(n=15；p＜0.01與正常10-5MORX-A組比較)，進一步證實ORX-A對PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用是通過激活G蛋白實現(xiàn)的。 2.PLC、PKC介導ORX-A所致的興奮效應(yīng)，而PKA不參

6、與該興奮效應(yīng) PLC抑制劑(D609)(10μM)(0.68±0.45mV,n=9；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)可阻斷ORX-A對PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用，相反，電極內(nèi)液加入PKA抑制劑(PKA抑制肽5-24)(1μM)對ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的作用無顯著影響(24.74±8.79mV,n=14，14of15；p＞0.05與正常10-5MORX-A組比較)。此外，胞外給PKC激動劑(TPA)(100

7、nM)可引起PFC錐體神經(jīng)元發(fā)生去極化反應(yīng)(25.43±7.23mV,n=6，6of7；p＞0.05與正常10-5MORX-A組比較)，而PKC抑制劑(BISⅡ)(1μM)則抑制ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元(0.62±0.34mV,n=11；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)。上述結(jié)果表明，ORX-A對PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用主要是由PLC-PKC而不是PKA介導的。 3.PLC-PKC信號通路介導的K+電流的

8、抑制與ORX-A興奮效應(yīng)有關(guān) 全細胞電壓鉗記錄表明，ORX-A(10-5M)可使全細胞K+電流發(fā)生顯著降低(n=21，p＜0.05)。PKC抑制劑，BISⅡ(1μM)(n=9；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)和PLC抑制劑，D609(10μM)(n=7；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)可分別阻斷ORX-A所致的K+電流降低。這些結(jié)果表明ORX-A對PFC錐體神經(jīng)元的興奮的機制是：ORX-A先活化PL

9、C-PKC信號通路，降低抑制性的K+電流，進而增加神經(jīng)元興奮性。 4.胞外鈣內(nèi)流參與ORX-A引起的胞內(nèi)鈣水平增加 鈣成像研究顯示ORX-A可引起25.6％(n=20，20of78)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加，且呈劑量依賴性。胞外無鈣情況下，ORX-A不能引起胞內(nèi)鈣增加(n=56；p＞0.05與空白對照組比較)。預(yù)孵鈣庫抑制劑thapsigargin(2μM)1h后，ORX-A仍能引起胞內(nèi)鈣增加(17.24％，n=5

10、，5of29；p＜0.05與空白對照組比較)。結(jié)果說明，ORX-A主要是通過胞外鈣內(nèi)流引起皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加。 此外，我們也觀察到ORX-A(10-6M)可引起急性分離的PFC神經(jīng)元發(fā)生與培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元類似的胞內(nèi)鈣增加。 綜上所述，本研究結(jié)果表明，第一，ORX-A主要是通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體，激活PLC-PKC，進而抑制K+電流的細胞信號途徑直接興奮PFC錐體神經(jīng)元。第二，ORX-A引起的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加主要