Orexin-A興奮大鼠皮層神經(jīng)元的細(xì)胞機(jī)制.pdf

1、Orexins，即hypocretins，是1998年分別被兩個(gè)研究組同時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，orexin神經(jīng)元主要位于外側(cè)下丘腦和穹隆區(qū)。Orexin系統(tǒng)包括來自同一前體物質(zhì)的二個(gè)單體orexin-A和orexin-B(ORX-A和ORX-B)。Orexins主要是通過活化兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體OX1R和OX2R發(fā)揮作用。大量研究已經(jīng)表明，orexins在促進(jìn)覺醒中發(fā)揮非常重要的作用，這種促覺醒作用主要是通過興奮多個(gè)皮層下覺醒系統(tǒng)，包括藍(lán)斑

2、去甲腎上腺素能神經(jīng)元、結(jié)節(jié)乳頭體組胺能神經(jīng)元、中腦腦橋和基底前腦膽堿能神經(jīng)元和非特異性丘腦皮層投射系統(tǒng)等。先前本室的研究發(fā)現(xiàn)，ORX-A可直接興奮大鼠前額葉皮層(prefrontalcortex，PFC)錐體神經(jīng)元，并呈劑量依賴性。這些研究結(jié)果表明orexin系統(tǒng)除了通過間接的皮層下覺醒通路外，還可通過直接的下丘腦皮層通路參與對(duì)覺醒的調(diào)控。Orexins興奮神經(jīng)元和非神經(jīng)元的機(jī)制研究現(xiàn)在已受到越來越多的關(guān)注。大量的研究結(jié)果已經(jīng)表明，or

3、exins在不同腦區(qū)和不同核團(tuán)是通過活化不同信號(hào)通路引起多種離子機(jī)制發(fā)揮興奮作用的。然而，關(guān)于orexins興奮皮層神經(jīng)元的機(jī)制，尤其是胞內(nèi)信號(hào)通路還鮮有報(bào)道。 此外，許多研究表明orexin受體激活另一主要表現(xiàn)為胞內(nèi)鈣增加。Orexins既可通過胞外鈣內(nèi)流又可通過胞內(nèi)鈣庫釋放或二者共同參與增加胞內(nèi)鈣水平。盡管已有研究表明orexins可增加皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣，但究竟是來自胞外鈣內(nèi)流還是胞內(nèi)鈣庫釋放仍需進(jìn)一步研究。 本

4、研究旨在通過膜片鉗技術(shù)和鈣成像技術(shù)對(duì)ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的機(jī)制進(jìn)行深入研究。首先，以急性分離的Wistar大鼠PFC錐體神經(jīng)元為研究對(duì)象，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)并結(jié)合藥理學(xué)方法，觀察ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的細(xì)胞機(jī)制。同時(shí)，在鈣成像中，采用新型鈣指示劑fluo-4/AM負(fù)載細(xì)胞，觀察ORX-A對(duì)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和急性分離的PFC錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣的影響及其作用機(jī)制。 1.G蛋白參與ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元

5、 電流鉗記錄顯示，ORX-A(10-5M)可使PFC錐體神經(jīng)元膜去極化和動(dòng)作電位發(fā)放頻率增加。電極內(nèi)液加入0.5mMGDP-β-S(GDP阻斷劑，可抑制G蛋白介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào))時(shí)，ORX-A不能引起皮層錐體神經(jīng)元發(fā)生任何興奮反應(yīng)(n=15；p＜0.01與正常10-5MORX-A組比較)，進(jìn)一步證實(shí)ORX-A對(duì)PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用是通過激活G蛋白實(shí)現(xiàn)的。 2.PLC、PKC介導(dǎo)ORX-A所致的興奮效應(yīng)，而PKA不參

6、與該興奮效應(yīng) PLC抑制劑(D609)(10μM)(0.68±0.45mV,n=9；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)可阻斷ORX-A對(duì)PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用，相反，電極內(nèi)液加入PKA抑制劑(PKA抑制肽5-24)(1μM)對(duì)ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元的作用無顯著影響(24.74±8.79mV,n=14，14of15；p＞0.05與正常10-5MORX-A組比較)。此外，胞外給PKC激動(dòng)劑(TPA)(100

7、nM)可引起PFC錐體神經(jīng)元發(fā)生去極化反應(yīng)(25.43±7.23mV,n=6，6of7；p＞0.05與正常10-5MORX-A組比較)，而PKC抑制劑(BISⅡ)(1μM)則抑制ORX-A興奮PFC錐體神經(jīng)元(0.62±0.34mV,n=11；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)。上述結(jié)果表明，ORX-A對(duì)PFC錐體神經(jīng)元的興奮作用主要是由PLC-PKC而不是PKA介導(dǎo)的。 3.PLC-PKC信號(hào)通路介導(dǎo)的K+電流的

8、抑制與ORX-A興奮效應(yīng)有關(guān) 全細(xì)胞電壓鉗記錄表明，ORX-A(10-5M)可使全細(xì)胞K+電流發(fā)生顯著降低(n=21，p＜0.05)。PKC抑制劑，BISⅡ(1μM)(n=9；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)和PLC抑制劑，D609(10μM)(n=7；p＜0.05與正常10-5MORX-A組比較)可分別阻斷ORX-A所致的K+電流降低。這些結(jié)果表明ORX-A對(duì)PFC錐體神經(jīng)元的興奮的機(jī)制是：ORX-A先活化PL

9、C-PKC信號(hào)通路，降低抑制性的K+電流，進(jìn)而增加神經(jīng)元興奮性。 4.胞外鈣內(nèi)流參與ORX-A引起的胞內(nèi)鈣水平增加 鈣成像研究顯示ORX-A可引起25.6％(n=20，20of78)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加，且呈劑量依賴性。胞外無鈣情況下，ORX-A不能引起胞內(nèi)鈣增加(n=56；p＞0.05與空白對(duì)照組比較)。預(yù)孵鈣庫抑制劑thapsigargin(2μM)1h后，ORX-A仍能引起胞內(nèi)鈣增加(17.24％，n=5

10、，5of29；p＜0.05與空白對(duì)照組比較)。結(jié)果說明，ORX-A主要是通過胞外鈣內(nèi)流引起皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加。 此外，我們也觀察到ORX-A(10-6M)可引起急性分離的PFC神經(jīng)元發(fā)生與培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元類似的胞內(nèi)鈣增加。 綜上所述，本研究結(jié)果表明，第一，ORX-A主要是通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體，激活PLC-PKC，進(jìn)而抑制K+電流的細(xì)胞信號(hào)途徑直接興奮PFC錐體神經(jīng)元。第二，ORX-A引起的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣增加主要