TGF-β1在BMSC移植可能對大鼠肝纖維及肝癌進程影響中的作用.pdf

1、目的：建立骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及擴增體系的基礎(chǔ)上，探討不同時期移植BMSC、移植時間長短以及移植途徑不同對大鼠肝纖維化進程的影響；從TGF-β1的角度出發(fā)，探討B(tài)MSC移植在肝纖維化進程中的作用機制以及可能在肝硬化后肝癌發(fā)生中的影響。 方法：1、應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化雄性SD大鼠BMSC，分別向成骨細胞，成脂肪細胞誘導(dǎo)分化進行鑒定。2、在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的第六周、第八周，將來自雄性SD大鼠的BMS

2、C以5×106/只的劑量經(jīng)尾靜脈注入同種雌性大鼠體內(nèi)。分別在BMSC移植4周及6周后處死各組大鼠，評價干預(yù)組與對照組的生存狀態(tài)，并用Scheuer炎癥活動度評分法和SchmidM纖維化評分法評價肝臟病理情況。3、在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的第六周，將來自雄性SD大鼠的BMSC以Sx106/只的劑量經(jīng)腹腔、經(jīng)尾靜脈及肝內(nèi)注射三種途徑移植入同種雌性大鼠體內(nèi)。BMSC移植6周后分別處死各組大鼠，評價各組的生存狀態(tài)，異形細胞發(fā)生率，Sche

3、uer炎癥活動度評分法和SchmidM纖維化評分法評價肝臟病理情況，免疫組化法檢測α-SMA評價肝星狀細胞(HSC)活化情況。4、在建立四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型與二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)性大鼠肝癌模型基礎(chǔ)上，分析TGF-β1及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在MSC移植減輕纖維化中的作用以及減少異形細胞發(fā)生從而可能對肝硬化后肝癌發(fā)生的影響。 結(jié)果： 第一部分：利用密度梯度離心法結(jié)合MSC塑料貼壁

4、生長的特性，從成年大鼠骨髓中分離、擴增培養(yǎng)獲得形態(tài)均-的細胞集落。并在體外不同的誘導(dǎo)條件下，將MSC誘導(dǎo)分化為成骨細胞、脂肪細胞，間接證明了本實驗從骨髓中分離得到的細胞為MSC。 第二部分：第六周移植BMSC，移植4周后處死的對照組和干預(yù)組在炎癥活動度方面無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.73和3.58(u=-0.421，P=0.853)，但在纖維化方面，SchmidM評分均值分別為5.54和4.75(u=-2.173

5、，P=0.041)。第六周移植BMSC，移植6周后處死的對照組與干預(yù)組，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.218，P<0.01)，SchmidM評分均值分別為5.17和1.58(u=-3.653，P<0101)。第六周移植BMSC，移植4周和6周后處死的兩組大鼠，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.214，P<0.001)；SchmidM評分均值分別為4.75和1.58(u=-3.79，P<

6、0.011)。第八周移植BMSC，移植4周后處死的對照組和干預(yù)組在炎癥活動度與纖維化評分方面均無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.58和3.64(u=-0.421，P=0.860)，SchmidM評分均值分別為5.17和5.27(u=-0.352，P=0.732)。第六周與第八周移植BMSC，均在造模12周后處死的兩組大鼠間，Scheuer評分的均值分別為0.42和3.64(u=-4.146，P<0.01)；SchmidM評分均

7、值分別為1.58和5.27(u=-3.88，P<0.01)。 第三部分：第六周移植BMSC，移植6周后處死的模型組與各干預(yù)組在生存率上無明顯差異。在腹水發(fā)生率上，模型組與經(jīng)尾靜脈干預(yù)組有顯著差異。模型組和經(jīng)腹腔移植干預(yù)組在炎癥活動度、纖維化以及肝星狀細胞活化程度上均無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.58和2.40(u=-1.58，P=0.11)，SchmidM評分均值分別為5.17和4.70(u=-0.82，P=0.4

8、1)，α-SMA評分均值分別為2.25和1.50(u=-1.37，P=0.17)。模型組與經(jīng)尾靜脈移植干預(yù)組和肝內(nèi)移植干預(yù)組在炎癥活動度、纖維化以及肝星狀細胞活化程度上均有顯著差異，Scheuer評分均值分別為3.58、0.42和1.27(u=-4.22，P<0.01；u=-3.13，P<0.01)；SchmidM評分均值分別為5.17、1.58和3.00(u=-3.65，P<0.01；u=-2.54，P<0.01)；α-SMA評分均值

9、分別為2.25、0.58和0.55(u=-2.93，P<0.01；u=-3.11，P<0.01)。各治療組間進行兩兩對比結(jié)果顯示：經(jīng)腹腔干預(yù)組與經(jīng)尾靜脈干預(yù)組在炎癥活動度、纖維化評分上以及α-SMA的表達上均有顯著差異(P<0.05)；經(jīng)尾靜脈干預(yù)組與肝內(nèi)干預(yù)組在炎癥活動度、纖維化評分以及肝星狀細胞活化方面均無明顯差異。而經(jīng)腹腔干預(yù)組與肝內(nèi)干預(yù)組在炎癥活動度、纖維化評分上無顯著差異(P>0.05)，但在肝星狀細胞活化方面有顯著差異(u=

10、-2.43，P=0.02)。模型組異形細胞發(fā)生率為50％，經(jīng)腹腔干預(yù)組為30％，經(jīng)尾靜脈干預(yù)組為O％，肝內(nèi)干預(yù)組為9.1％。模型組與各干預(yù)組間在發(fā)生率上均有顯著差異。 第四部分：在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中，模型組與干預(yù)組在肝臟炎癥活動度、纖維化程度及HSC的活化情況上有顯著差異，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.22，P<0.01)，SchmidM評分均值分別為5.17和1.58(u=-3.65，P

11、<0.01)，α-SMA評分均值分別為2.25和0.58(u=-2.93，P<0.01)。異形細胞發(fā)生率在模型組為50％，干預(yù)組為0％(P<0.05)。TGF-β1含量在兩組間也有顯著差異(F=11.024，p=0.029)，而兩組間TGF-β1信號傳導(dǎo)蛋白smad4和smad7無明顯差異(F=0.178，p=0.695，F(xiàn)=0.00，p=0.986)。在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)性大鼠肝癌模型中，

12、BMSC移植可以抑制細胞周期(G1期P=0.000，G2期P=0.000，S期P=0.000)，但不能減少肝癌發(fā)生(63.64％和33.36％，X2=2.112，P=0.22)，不能減輕肝臟炎癥活動度、纖維化程度及HSC的活化，Scheuer評分均值分別為1.82和1.75(u=-0.39，P=1.00)，SchmidM評分均值分別為5.91和5.83(u=-0.58，P=0.86)，α-SMA評分均值分別為2.00和2.67(u=-1

13、.08，P=0.29)。TGF-β1及smad4、smad7的含量在兩組間亦無差異(F=1.538，p=0.283，F(xiàn)=4.989，p=0.298，F(xiàn)=2.698，p=0.176)。 結(jié)論： 1、密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法適合于分離純化MSC，可滿足組織工程研究對大量細胞的需求。 2、肝纖維化形成早期移植BMSC可以減輕CCL4引起的肝臟炎癥程度，改善大鼠的肝纖維化程度，且與移植時間成正相關(guān)。 3、經(jīng)腹

14、腔移植BMSC對大鼠肝纖維化進程無顯著影響；經(jīng)尾靜脈與肝內(nèi)移植BMSC均可顯著減輕肝纖維化大鼠肝臟的炎癥與纖維化程度；BMSC移植可以減少肝星狀細胞的激活，減少肝纖維化進程中異形細胞發(fā)生率。 4、本研究提示，BMSC移植可能是通過抑制TGF-β1的分泌，減輕炎癥程度，減少肝星狀細胞激活進而減緩肝纖維化進程。在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中，BMSC可能通過減少TGF-β1含量調(diào)控細胞周期，進而減少異形細胞，但在二乙基亞硝胺誘發(fā)性