Osteopontin在TGF-β1介導(dǎo)的肝纖維化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解失衡導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)堆積，各種慢性肝損傷因素均可導(dǎo)致肝纖維化。嚴(yán)重的肝纖維化臨床診斷為肝硬化，如果缺乏有效的干預(yù)措施，可向肝臟衰竭，甚至肝癌進(jìn)展。
　　在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞的作用越來越受到研究者的重視，它是目前公認(rèn)的細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。正常情況下，肝星狀細(xì)胞存在于竇周間隙，主要發(fā)揮儲(chǔ)藏維生素A的功能。在損傷信號(hào)的刺激下，靜止的肝星狀細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)分化為活化的肌成纖維樣細(xì)胞，表現(xiàn)出增殖能力增強(qiáng)，凋亡

2、率降低，生成細(xì)胞外基質(zhì)能力增強(qiáng)等特性。肝星狀細(xì)胞的活化需要各種細(xì)胞因子如PDGF、TGF-β1、leptin和VEGF等通過自分泌或旁分泌作用維持。其中TGF-β1被公認(rèn)為肝星狀細(xì)胞活化的最強(qiáng)刺激因子。
　　本研究的興趣分子骨橋蛋白（Osteopontin，OPN)）是一種分泌性的磷酸化糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與多種生理病理過程。主要通過與細(xì)胞膜表面的整合素受體和CD44結(jié)合發(fā)揮作用。越來越多的證據(jù)表明OPN參與了機(jī)體的纖維化過

3、程。我們的前期研究在HBV引起的肝纖維化患者的血漿中發(fā)現(xiàn)，OPN與肝纖維化程度密切相關(guān)。同時(shí)，有研究報(bào)道OPN在不同情況下都可以受到TGF-β1的誘導(dǎo)參與TGF-β1下游的生理病理過程。這些結(jié)果都提示OPN在纖維化過程中的作用與TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)。
　　本研究的目的為研究OPN在肝硬化患者組織和血漿中的表達(dá)；探討其促人肝星狀細(xì)胞活化機(jī)制。
　　首先，我們通過免疫組化染色觀察61例肝硬化患者和23例正常對(duì)照肝組織中OPN

4、表達(dá)，分析其與Child-Pugh分級(jí)、MELD評(píng)分和并發(fā)癥發(fā)生的相關(guān)性；ELISA檢測(cè)31例肝硬化患者血漿中OPN和TGF-β1的表達(dá)并分析二者相關(guān)性。免疫組化結(jié)果顯示，肝硬化組織中OPN表達(dá)陽性率（46/61）顯著高于正常對(duì)照(9/23，P=0.000)。同時(shí)OPN表達(dá)強(qiáng)度與Child-Pugh分級(jí)、MELD評(píng)分和并發(fā)癥發(fā)生具有相關(guān)性(P=0.000，P=0.000，P=0.005)。肝硬化患者血漿中，OPN與TGF-β1的表達(dá)量呈

5、正相關(guān)（PearsonCorrelation:0.621，P=0.000）。
　　接下來，我們利用慢病毒過表達(dá)/干涉人肝星狀細(xì)胞系LX-2中OPN的表達(dá)。我們構(gòu)建了基于FUW和pLKO.1的慢病毒過表達(dá)/干涉載體，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒。經(jīng)慢病毒介導(dǎo)，過表達(dá)/干涉人肝星狀細(xì)胞系LX-2中OPN的表達(dá)。通過qPCR、westernblot檢測(cè)細(xì)胞中OPN表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)慢病毒過表達(dá)/干涉有效。
　　為探討

6、OPN過表達(dá)/干涉對(duì)人肝星狀細(xì)胞系LX-2活化表型的影響，我們通過CCK8檢測(cè)、qPCR技術(shù)在人肝星狀細(xì)胞系LX-2中，觀察LX-2增殖及活化標(biāo)志物的變化。結(jié)果顯示，OPN上調(diào)可促進(jìn)LX-2增殖，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物（α-SMA,CollagenI,TIMP1）的表達(dá)，OPN下調(diào)則導(dǎo)致相反結(jié)果。
　　為進(jìn)一步明確OPN在肝纖維化情況下上調(diào)的機(jī)制，我們著重研究TGF-β1在人肝星狀細(xì)胞系LX-2中對(duì)OPN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們構(gòu)建了O

7、PN啟動(dòng)子載體，結(jié)合生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究OPN上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，OPN可受到TGF-β1的正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)合生物信息學(xué)分析和以往發(fā)表文獻(xiàn)，鎖定轉(zhuǎn)錄因子RUNX2作為研究對(duì)象。結(jié)果顯示，TGF-β1可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2表達(dá)，而RUNX2可增強(qiáng)OPN啟動(dòng)子活性，且結(jié)合生物信息學(xué)分析和啟動(dòng)子截短分析，初步確定RUNX2作用位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列的-78～-73的ACCACA。
　　綜上所述，我們得到以下結(jié)