自體移植內皮祖細胞防治多器官功能障礙的研究.pdf

1、創(chuàng)傷會導致機體的靶細胞嚴重損傷,同時由于感染所致的膿毒癥及非感染所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflaromatory response syndrome,SIRS)相互作用使得自體修復功能障礙,并進一步造成微血管損傷、微循環(huán)障礙,從而引起重要臟器功能障礙,這可能就是器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的始發(fā)環(huán)節(jié)。而MODS是重癥監(jiān)護病房(intensive c

2、are unit,ICU)患者死亡的最常見原因。 近年來研究表明：骨髓中有一群能夠在生理性或病理性因素的刺激下,動員到外周血并分化為成熟內皮細胞(Endothelium cell,EC)以促進血管新生,并可以分化為相應的組織細胞進行損傷修復的祖細胞,這些細胞被稱為內皮祖細胞(Endothelialprogenitor cell,EPC)。EPC過去被認為是胚胎時期血管新生最主要的細胞,而越來越多的證據(jù)顯示EPC也是出生后生理性及

3、病理性血管形成最主要的細胞,并參與心、肝、肺、腎等單個器官障礙時的修復：同時遷徙到損傷部位的EPC還可以對不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反應,依次釋放血管活性物質、生長因子以及參與免疫調節(jié)的細胞因子和趨化因子,參與創(chuàng)傷后的炎癥反應。 目前研究認為EPC主要有2類：一類是來源于骨髓和剛被動員進入外周循環(huán)的早期EPC,它們都表達三種祖細胞分子標志:CD133(AC133)、CD34和血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2

4、、KDR或Flk-1),而不表達VE-鈣黏素(VE-cadherin)和血小板內皮細胞粘附分子-1(CD31);另一類是晚期EPC:即早期EPC釋放入外周血循環(huán)或經(jīng)體外培養(yǎng)后則逐漸失去CD133和CD34表達等祖細胞特性,并開始表達內皮系的特征性分子標志:CD31和KDR等,同時可吞噬乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)和荊豆凝集素(UEA-1)。CD133和KDR是造血干細胞和內皮細胞的重要標志,在胚胎早期血管也有表達,因而通常被用作為

5、識別EPC的標志之一。 目前國內外對EPC的分離和體外培養(yǎng)方法尚未達成一致,本實驗根據(jù)國內外文獻的比較以及實驗中的歸納總結,以密度梯度法分離小型豬骨髓中單個核細胞,并通過體外經(jīng)VEGF等生長因子誘導培養(yǎng)后得到EPC;并對培養(yǎng)出的EPC進行細胞形態(tài)學；細胞表型；細胞增殖特征；體外血管形成功能及細胞吞噬Ac-LDL和UEA-1來進行鑒定。 本研究顯示,EPC可以在機體發(fā)生MODS后向不同組織遷徙或歸巢,發(fā)揮組織修復作用,并通

6、過毛細血管的新生以改善創(chuàng)傷后缺血缺氧引起的臟器功能障礙,自體移植EPC可以降低MODS的發(fā)生率,并改善MODS的預后。為此,本文從EPC對自體修復的角度出發(fā),探討MODS發(fā)病機理及自體移植EPC預防和治療MODS的理論依據(jù)。 本研究共分四部分,首先通過內毒素+失血性休克制造出MODS的動物模型,并在MODS的各個階段進行外周血中EPC的監(jiān)測,同時在體外建立起EPC培養(yǎng)和鑒定體系,將體外培養(yǎng)增殖的自體EPC移植入MODS的動物,觀

7、察移植后MODS的發(fā)生率和重要臟器的功能改善情況,評價自體移植EPC防治MODS的效果,并對其作用機制進行初步探討。 第一部分 多器官功能障礙動物模型的建立 復制了雙相遲發(fā)型的豬MODS模型,將為研究自體移植內皮祖細胞防治創(chuàng)傷后多器官功能障礙的作用提供了實驗的基礎。 將體重25～30 Kg健康雄性家豬隨機分為2組：實驗組(MODS)10只,施行失血性休克+內毒素血癥復合因素；對照組(C)9只,施行假手術,予以股

8、動靜脈置管,不實施失血及內毒素注射。用自動分析儀檢測wBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、動脈血氧分壓(Pa02),以上各指標采用自身對照,以判斷器官功能,主要器官病理形態(tài)學檢查(大體、光鏡)。 結果顯示：實驗組WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明顯升高,動物死亡前顯著高于正常值,PaO2明顯下降。病理學改變主要表現(xiàn)為衰竭器官呈以炎癥為主的非特異性改變。實驗組MODS發(fā)生率為90％,死亡率為80％

9、,顯著高于對照組。本實驗采用二次打擊,與臨床實際相符,且MODS的發(fā)生率及死亡率均高,操作簡單,容易復制,是一個較成功的動物模型。 第二部分 外周循環(huán)中內皮祖細胞在MODS各個階段的數(shù)量和功能變化及意義 通過監(jiān)測MODS各個階段,外周循環(huán)中內皮祖細胞的數(shù)量和功能變化,旨在為自體移植內皮祖細胞防治MODS奠定理論的基礎同時確定最佳的自體移植時間。 按照上述方法造模后,分別在正常狀態(tài)下、手術后、失血后2小時、血液回

10、輸后2小時、輸注內毒素后1小時、12小時、24小時、48小時、96小時取外周血。以密度梯度法分離出單個核細胞(PMC,peripheral mononuclear cells),對其進行CD133和CD34雙重標記,CD133+和KDR+雙標記陽性者被認為是外周血中的EPC,并通過流式細胞儀技術對EPC進行計數(shù)。同時取外周血中以密度梯度法分離出的PMC按照1×106/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內,培養(yǎng)96小時后,進行細胞增殖、貼壁、遷徙和

11、血管形成功能的測定,比較不同時間點外周血中EPC的功能變化。 結果顯示：在MODS的形成過程中,外周循環(huán)中EPC較正常組外周循環(huán)中EPC數(shù)量先增加隨后出現(xiàn)明顯的下降,并且其增殖、黏附、遷移和血管形成功能較正常組明顯減退,說明MODS的發(fā)生和發(fā)展過程中的炎癥的不斷加重對EPC數(shù)量及功能具有明顯的影響作用,同時由于EPC數(shù)量及功能出現(xiàn)明顯的下降,導致重要的臟器功能損傷。 第三部分 小型豬骨髓內皮祖細胞的體外培養(yǎng)、鑒定和功能

12、檢測 建立起小型豬骨髓EPCs的標準化分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定的方法,為自體移植內皮祖細胞防止MODS提供合理的技術平臺。 用密度梯度離心法從豬骨髓中分離出BMMC,按照1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內,使用添加了細胞因子和胎牛血清的內皮祖細胞專用培養(yǎng)液進行誘導分化培養(yǎng),在固定時間進行消化、傳代和擴增。同時,觀察培養(yǎng)27天時P6代EPC的生長情況,并對其進行細胞形態(tài)學特征、細胞的超微結構、免疫組化、流式細胞儀技術、乙

13、酰化的低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能鑒定,為后文的自體移植做準備。 結果顯示：培養(yǎng)48小時后逐漸出現(xiàn)梭形貼壁細胞(attaching cells,AT cells),并出現(xiàn)成簇現(xiàn)象,培養(yǎng)第6天時的EPC,已經(jīng)開始出現(xiàn)成集落的貼壁細胞。在電鏡下觀察細胞；細胞內可檢測到典型的Weibel-Palade小體。超過85％體外培養(yǎng)的貼壁細胞都特異性地攝取了Dil-A

14、c-LDL和FITC-UEA-1。在免疫組化鑒定:CD133(+),CD34(+),CD31(++),KDR(++)。流式細胞儀技術鑒定:CD133的陽性率：18.23±7.12％；CD34的陽性率：47.71±14.85％；CD31的陽性率：71.61±13.51％；KDR的陽性率：87.24±11.40％。體外血管生成功能提示：細胞在特殊的細胞培養(yǎng)環(huán)境中可以生成新生的血管。 第四部分 自體移植內皮祖細胞防治創(chuàng)傷后多器官功能

15、障礙的研究 探討自體移植骨髓EPC對小型豬創(chuàng)傷后多器官功能障礙治療的有效性和安全性的研究,同時比較不同數(shù)量EPC進行移植治療的療效差異。 預先抽取實驗動物骨髓,按照前述的方法進行EPC的分離、培養(yǎng)和擴增。后按照前述方法造模,將達到MODS的動物隨機分為三組,分別按照1×106個細胞/Kg體重(低劑量移植組、LT組,8只)和1×107個細胞/Kg體重(高劑量移植組、HT組,8只)進行自體EPC移植治療,同時以未行任何干預的

16、MODS(M組,10只)作為對照組。 結果：低劑量移植組(LT)實驗動物MODS的發(fā)生率和死亡率分別為(75％；6/8、75％；6/8)明顯高于高劑量移植組(HT)實驗動物(50％；4/8、37.5％；3/8),但低于單純MODS組(90％；9/10、80％；8/10)(P<0.01);同時LT組實驗動物的生存時間(78.47±44.12小時)也較HT組實驗動物(156.18±72.87小時)明顯縮短。LT組實驗動物在MODS各

17、個階段的WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均高于HT組,但較單純MODS組略有降低。提示自體移植內皮祖細胞可以有效的促進創(chuàng)傷后的修復,防止MODS的發(fā)生和發(fā)展,同時可改善MODS動物的預后以及延長生存時間。 結論：體內EPC的數(shù)量減少及功能障礙可能是MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一,自體移植內皮祖細胞可以在機體發(fā)生MODS后向不同組織遷徙或歸巢,發(fā)揮組織修復作用,并通過毛細血管的新生以改善創(chuàng)傷后缺血缺氧引起的臟器功