移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)hVEGF-,165--GFP的雙表達(dá)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞防治多器官功能障礙研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合癥(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)患者死亡的最常見原因。經(jīng)過對(duì)MODS的深入研究，目前多數(shù)學(xué)者已認(rèn)可MODS發(fā)生的重要機(jī)制之一為：當(dāng)機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷后，因創(chuàng)傷本身及各種炎癥反應(yīng)的刺激，導(dǎo)致機(jī)體全身微血管內(nèi)皮的損傷與修復(fù)失衡以及微循環(huán)障礙，從而引發(fā)多個(gè)器官功能的障礙。
　　 自1997年，Asahara等首先從外周血單個(gè)核細(xì)胞(Periphera

2、l mononuclear cells，PMCs)里分離出內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)以來。這類在生理性或病理性因素的刺激下能夠從骨髓中動(dòng)員到外周血并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞(Endotheliumcells，ECs)以促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)及血管新生的細(xì)胞已受到人們的廣泛重視，大量的體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明EPCs是個(gè)體出生后生理性及病理性促血管修復(fù)及新生的最主要的細(xì)胞，并參與心、肝、肺、腎等單個(gè)器官

3、內(nèi)微循環(huán)的修復(fù)。
　　 VEGF(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮特異絲裂原，能保持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的促血管生成因子和促內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子。慢病毒(Lentivital vector，LV)載體系統(tǒng)具有高效而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率且毒副作用小，現(xiàn)已廣泛的用于各種疾病的轉(zhuǎn)基因治療中。同時(shí)，可表達(dá)

4、熒光信號(hào)的報(bào)告基因--綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein GFP)已普遍的應(yīng)用于觀察活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及移植細(xì)胞在體內(nèi)定位的情況，使得在分子及細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)示蹤生物學(xué)的發(fā)生及變化過程成為可能。本研究以慢病毒為載體，將VEGF+GFP雙表達(dá)基因轉(zhuǎn)染至EPCs內(nèi)，研究轉(zhuǎn)染后的EPCs在體外的增殖、遷移、分化及對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷后主要炎性因子的抗殺傷能力，在移植EPCs治療后觀察其在活體內(nèi)的分布情況以及對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷所引發(fā)的M

5、ODS的防治作用。
　　 本研究共分為三部分，首先在體外建立起EPCs的培養(yǎng)和鑒定體系；其次構(gòu)建LV-VEGF-GFP載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染EPCs，體外鑒定其增殖、遷移、分化及對(duì)炎性因子的抗殺傷能力；最后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs移植治療MODS的動(dòng)物，觀察EPCs在體內(nèi)的分布情況及移植后MODS的發(fā)生率和重要臟器的功能改善情況，評(píng)價(jià)移植EPCs防治MODS的效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 第一部分兔骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)

6、、鑒定和功能檢測(cè)
　　 目的：優(yōu)化兔骨髓EPCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定的方法，為移植EPCs防治MODS提供合理的技術(shù)平臺(tái)。
　　 方法：用密度梯度離心法從兔骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞，按照1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，使用添加了細(xì)胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，在固定時(shí)間進(jìn)行消化、傳代和擴(kuò)增。同時(shí)，觀察培養(yǎng)14天時(shí)P3代EPCs的生長(zhǎng)情況，并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、免疫組化、

7、流式細(xì)胞儀技術(shù)、乙?；牡兔芏戎鞍?Dil-Ae-LDL)和荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)48小時(shí)后逐漸出現(xiàn)梭形貼壁細(xì)胞(attaching cells，AT cells)，并出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，培養(yǎng)至第6天時(shí)的EPCs，已經(jīng)開始出現(xiàn)成集落的貼壁細(xì)胞。在電鏡下觀察細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到典型的Weibel-Palade小體。超過85％體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞都特異性地?cái)z

8、取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫組化鑒定： CD133(+)，CD34(+)，CD31(++)，KDR(++)。流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定： CD133的陽(yáng)性率：18.23±7.12％；CD34的陽(yáng)性率：47.71±14.85％；CD31的陽(yáng)性率：71.61±13.51％；KDR的陽(yáng)性率：87.24±11.40％。體外血管生成功能提示：EPCs在特殊的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中可以生成新生的血管。
　　 結(jié)論：利用密度梯度離心法

9、可穩(wěn)定的獲得單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得純度較高的，具有正常生理功能的EPCs。
　　 第二部分：含hVEGF165+GFP雙表達(dá)基因的慢病毒載體的建立及感染EPCs后的功能鑒定
　　 目的：構(gòu)建可穩(wěn)定攜帶hVEGF165+GFP雙表達(dá)基因的慢病毒載體，高效轉(zhuǎn)染EPCs，提高EPCs增殖、遷移、分化、成血管以及對(duì)缺血缺氧和炎癥因子的抵抗力。
　　 方法：設(shè)計(jì)并合成：hVEGF165的PCR引物：hVEGF1

10、65-F：5’-CGG GAT CCA TGAACT TTC TGC TG-3’：hVEGF165-R：5’-CGA CGC GTC CGC CTC GGC TTG TCT-3’。以pDC316-hVEGF165質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。酶切回收產(chǎn)物經(jīng)pWPXL-MOD質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆并抽提質(zhì)粒后利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ雙酶切，電泳鑒定重組質(zhì)粒后測(cè)序。
　　 采用四質(zhì)粒系統(tǒng)的慢病毒包裝質(zhì)粒，其組成為pRs

11、v-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G以及含hVEGF165-GFP的pWPXL-MOD。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包裝所必須的元件。質(zhì)粒載體以磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，經(jīng)濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，采用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度。
　　 解凍經(jīng)培養(yǎng)純化的EPCs以1×106/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，觀察EPCs鋪

12、滿60％皿底后更換培養(yǎng)液。稀釋濃縮病毒，以MOI值為50感染EPCs，共孵育24h，細(xì)胞鋪滿80％-85％皿底后傳代，經(jīng)數(shù)次傳代后可擴(kuò)增細(xì)胞。對(duì)感染后的EPCs細(xì)胞進(jìn)行增值、遷移、分化、成血管能力及凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：經(jīng)純化濃縮后的慢病毒的最終滴度為5.0×108 TU/m。以MOI值為50轉(zhuǎn)染EPCs其平均感染效率為87.9％±5.6％。經(jīng)慢病毒感染后的EPCs的功能鑒定提示：遷移及成血管能力較未感染的EPCs略有增強(qiáng)

13、；增值、分化及抗凋亡能力明顯增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：EPCs經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后可將hVEGF165-GFP雙表達(dá)基因整合入細(xì)胞基因組中。EPCs的增值，遷移，分化，成血管及抗炎性殺傷能力得到增強(qiáng)，為在體外短時(shí)間能獲得具有較強(qiáng)的抗炎性因子殺傷作用及較高靶向遷移能力的EPCs奠定基礎(chǔ)。EPCs的分化能力的提高使得EPCs在體外向成熟內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的速度加快，降低了EPCs自我更新及體外傳代的能力。
　　 第三部分移植未轉(zhuǎn)染與經(jīng)轉(zhuǎn)染的E

14、PCs防治創(chuàng)傷后多器官功能障礙的研究
　　 目的：旨在探討移植經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的骨髓來源的EPCs對(duì)兔創(chuàng)傷后多器官功能障礙治療的有效性和安全性的研究，同時(shí)比較經(jīng)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的EPCs進(jìn)行移植治療后的療效差異。
　　 方法：預(yù)先抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓，按照前述的方法進(jìn)行EPCs的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增。利用二次打擊建立雙相遲發(fā)型家兔MODS動(dòng)物模型，將達(dá)到MODS的動(dòng)物隨機(jī)分為五組，以1×107個(gè)細(xì)/Kg體重為回輸劑量，按照：A組：轉(zhuǎn)染L

15、V-hVEGF165-GFP的EPCs實(shí)驗(yàn)組(12只)；B組：轉(zhuǎn)染LV-GFP的EPCs實(shí)驗(yàn)組(12只)；C組：未經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs實(shí)驗(yàn)組(12只)；同時(shí)以D組：肌注hVEGF165治療組及E組：未行任何干預(yù)的MODS(12只)及作為對(duì)照組。觀察不同實(shí)驗(yàn)組的EPCs進(jìn)行移植治療后EPCs在體內(nèi)的分布態(tài)勢(shì)對(duì)機(jī)體各個(gè)重要臟器的改善情況。
　　 結(jié)果： E組：?jiǎn)渭僊ODS實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物死亡率為75％(12只死亡9只)；而A組：移植LV/hV

16、EGF165-GFP-EPCs組的死亡率為25％(12只死亡3只)；B組：移植LV-GFP-EPCs組動(dòng)物的死亡率為58.3％(12只死亡7只)；C組：普通EPCs組動(dòng)物的死亡率50％(12只死亡6只)；D組：肌注hVEGF165組動(dòng)物的死亡率為83.3％(12只死亡10只)。同時(shí)A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存時(shí)間(136.48±42.27小時(shí))也較其他各組(B組：87.79±24.12小時(shí)；C組90.34±23.92小時(shí)；D組：59.21±20.

17、35小時(shí)；E組：63.45±23.55小時(shí))明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的hVEGF165-GFP雙表達(dá)基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以有效的抵抗嚴(yán)重創(chuàng)傷后機(jī)體內(nèi)環(huán)境炎性因子對(duì)EPCs的殺傷作用并促進(jìn)創(chuàng)傷后的微循環(huán)修復(fù)，防止MODS的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)可改善MODS動(dòng)物的預(yù)后以及延長(zhǎng)生存時(shí)間。
　　 小結(jié)：機(jī)體發(fā)生炎癥的創(chuàng)傷時(shí)，體內(nèi)EPCs的數(shù)量減少及功能障礙可能是MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，移植的