移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)hVEGF-,165--GFP的雙表達基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞防治多器官功能障礙研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合癥(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是重癥監(jiān)護病房內(nèi)患者死亡的最常見原因。經(jīng)過對MODS的深入研究，目前多數(shù)學(xué)者已認可MODS發(fā)生的重要機制之一為：當機體發(fā)生嚴重創(chuàng)傷后，因創(chuàng)傷本身及各種炎癥反應(yīng)的刺激，導(dǎo)致機體全身微血管內(nèi)皮的損傷與修復(fù)失衡以及微循環(huán)障礙，從而引發(fā)多個器官功能的障礙。
　　 自1997年，Asahara等首先從外周血單個核細胞(Periphera

2、l mononuclear cells，PMCs)里分離出內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)以來。這類在生理性或病理性因素的刺激下能夠從骨髓中動員到外周血并分化為成熟內(nèi)皮細胞(Endotheliumcells，ECs)以促進內(nèi)皮修復(fù)及血管新生的細胞已受到人們的廣泛重視，大量的體外實驗及動物實驗表明EPCs是個體出生后生理性及病理性促血管修復(fù)及新生的最主要的細胞，并參與心、肝、肺、腎等單個器官

3、內(nèi)微循環(huán)的修復(fù)。
　　 VEGF(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮特異絲裂原，能保持內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最強效的促血管生成因子和促內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化的重要細胞因子。慢病毒(Lentivital vector，LV)載體系統(tǒng)具有高效而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率且毒副作用小，現(xiàn)已廣泛的用于各種疾病的轉(zhuǎn)基因治療中。同時，可表達

4、熒光信號的報告基因--綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein GFP)已普遍的應(yīng)用于觀察活細胞內(nèi)基因表達及移植細胞在體內(nèi)定位的情況，使得在分子及細胞水平上實現(xiàn)示蹤生物學(xué)的發(fā)生及變化過程成為可能。本研究以慢病毒為載體，將VEGF+GFP雙表達基因轉(zhuǎn)染至EPCs內(nèi)，研究轉(zhuǎn)染后的EPCs在體外的增殖、遷移、分化及對嚴重創(chuàng)傷后主要炎性因子的抗殺傷能力，在移植EPCs治療后觀察其在活體內(nèi)的分布情況以及對嚴重創(chuàng)傷所引發(fā)的M

5、ODS的防治作用。
　　 本研究共分為三部分，首先在體外建立起EPCs的培養(yǎng)和鑒定體系；其次構(gòu)建LV-VEGF-GFP載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染EPCs，體外鑒定其增殖、遷移、分化及對炎性因子的抗殺傷能力；最后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs移植治療MODS的動物，觀察EPCs在體內(nèi)的分布情況及移植后MODS的發(fā)生率和重要臟器的功能改善情況，評價移植EPCs防治MODS的效果，并對其作用機制進行初步探討。
　　 第一部分兔骨髓內(nèi)皮祖細胞的體外培養(yǎng)

6、、鑒定和功能檢測
　　 目的：優(yōu)化兔骨髓EPCs的分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定的方法，為移植EPCs防治MODS提供合理的技術(shù)平臺。
　　 方法：用密度梯度離心法從兔骨髓中分離出單個核細胞，按照1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，使用添加了細胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，在固定時間進行消化、傳代和擴增。同時，觀察培養(yǎng)14天時P3代EPCs的生長情況，并通過細胞形態(tài)學(xué)特征、細胞的超微結(jié)構(gòu)、免疫組化、

7、流式細胞儀技術(shù)、乙?；牡兔芏戎鞍?Dil-Ae-LDL)和荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能等方法對其進行鑒定。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)48小時后逐漸出現(xiàn)梭形貼壁細胞(attaching cells，AT cells)，并出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，培養(yǎng)至第6天時的EPCs，已經(jīng)開始出現(xiàn)成集落的貼壁細胞。在電鏡下觀察細胞；細胞內(nèi)可檢測到典型的Weibel-Palade小體。超過85％體外培養(yǎng)的貼壁細胞都特異性地攝

8、取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫組化鑒定： CD133(+)，CD34(+)，CD31(++)，KDR(++)。流式細胞儀技術(shù)鑒定： CD133的陽性率：18.23±7.12％；CD34的陽性率：47.71±14.85％；CD31的陽性率：71.61±13.51％；KDR的陽性率：87.24±11.40％。體外血管生成功能提示：EPCs在特殊的細胞培養(yǎng)環(huán)境中可以生成新生的血管。
　　 結(jié)論：利用密度梯度離心法

9、可穩(wěn)定的獲得單個核細胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得純度較高的，具有正常生理功能的EPCs。
　　 第二部分：含hVEGF165+GFP雙表達基因的慢病毒載體的建立及感染EPCs后的功能鑒定
　　 目的：構(gòu)建可穩(wěn)定攜帶hVEGF165+GFP雙表達基因的慢病毒載體，高效轉(zhuǎn)染EPCs，提高EPCs增殖、遷移、分化、成血管以及對缺血缺氧和炎癥因子的抵抗力。
　　 方法：設(shè)計并合成：hVEGF165的PCR引物：hVEGF1

10、65-F：5’-CGG GAT CCA TGAACT TTC TGC TG-3’：hVEGF165-R：5’-CGA CGC GTC CGC CTC GGC TTG TCT-3’。以pDC316-hVEGF165質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。酶切回收產(chǎn)物經(jīng)pWPXL-MOD質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆并抽提質(zhì)粒后利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ雙酶切，電泳鑒定重組質(zhì)粒后測序。
　　 采用四質(zhì)粒系統(tǒng)的慢病毒包裝質(zhì)粒，其組成為pRs

11、v-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G以及含hVEGF165-GFP的pWPXL-MOD。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包裝所必須的元件。質(zhì)粒載體以磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，經(jīng)濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。
　　 解凍經(jīng)培養(yǎng)純化的EPCs以1×106/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，觀察EPCs鋪

12、滿60％皿底后更換培養(yǎng)液。稀釋濃縮病毒，以MOI值為50感染EPCs，共孵育24h，細胞鋪滿80％-85％皿底后傳代，經(jīng)數(shù)次傳代后可擴增細胞。對感染后的EPCs細胞進行增值、遷移、分化、成血管能力及凋亡實驗檢測。
　　 結(jié)果：經(jīng)純化濃縮后的慢病毒的最終滴度為5.0×108 TU/m。以MOI值為50轉(zhuǎn)染EPCs其平均感染效率為87.9％±5.6％。經(jīng)慢病毒感染后的EPCs的功能鑒定提示：遷移及成血管能力較未感染的EPCs略有增強

13、；增值、分化及抗凋亡能力明顯增強。
　　 結(jié)論：EPCs經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后可將hVEGF165-GFP雙表達基因整合入細胞基因組中。EPCs的增值，遷移，分化，成血管及抗炎性殺傷能力得到增強，為在體外短時間能獲得具有較強的抗炎性因子殺傷作用及較高靶向遷移能力的EPCs奠定基礎(chǔ)。EPCs的分化能力的提高使得EPCs在體外向成熟內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化的速度加快，降低了EPCs自我更新及體外傳代的能力。
　　 第三部分移植未轉(zhuǎn)染與經(jīng)轉(zhuǎn)染的E

14、PCs防治創(chuàng)傷后多器官功能障礙的研究
　　 目的：旨在探討移植經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的骨髓來源的EPCs對兔創(chuàng)傷后多器官功能障礙治療的有效性和安全性的研究，同時比較經(jīng)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的EPCs進行移植治療后的療效差異。
　　 方法：預(yù)先抽取實驗動物骨髓，按照前述的方法進行EPCs的分離、培養(yǎng)和擴增。利用二次打擊建立雙相遲發(fā)型家兔MODS動物模型，將達到MODS的動物隨機分為五組，以1×107個細/Kg體重為回輸劑量，按照：A組：轉(zhuǎn)染L

15、V-hVEGF165-GFP的EPCs實驗組(12只)；B組：轉(zhuǎn)染LV-GFP的EPCs實驗組(12只)；C組：未經(jīng)轉(zhuǎn)染的EPCs實驗組(12只)；同時以D組：肌注hVEGF165治療組及E組：未行任何干預(yù)的MODS(12只)及作為對照組。觀察不同實驗組的EPCs進行移植治療后EPCs在體內(nèi)的分布態(tài)勢對機體各個重要臟器的改善情況。
　　 結(jié)果： E組：單純MODS實驗組動物死亡率為75％(12只死亡9只)；而A組：移植LV/hV

16、EGF165-GFP-EPCs組的死亡率為25％(12只死亡3只)；B組：移植LV-GFP-EPCs組動物的死亡率為58.3％(12只死亡7只)；C組：普通EPCs組動物的死亡率50％(12只死亡6只)；D組：肌注hVEGF165組動物的死亡率為83.3％(12只死亡10只)。同時A組實驗動物的生存時間(136.48±42.27小時)也較其他各組(B組：87.79±24.12小時；C組90.34±23.92小時；D組：59.21±20.

17、35小時；E組：63.45±23.55小時)明顯延長(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的hVEGF165-GFP雙表達基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細胞可以有效的抵抗嚴重創(chuàng)傷后機體內(nèi)環(huán)境炎性因子對EPCs的殺傷作用并促進創(chuàng)傷后的微循環(huán)修復(fù)，防止MODS的發(fā)生和發(fā)展，同時可改善MODS動物的預(yù)后以及延長生存時間。
　　 小結(jié)：機體發(fā)生炎癥的創(chuàng)傷時，體內(nèi)EPCs的數(shù)量減少及功能障礙可能是MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，移植的