p53過表達對Ki-67基因核心啟動子活性的影響.pdf

1、目的：鑒定p53過表達對Ki-67基因核心啟動子活性的影響并探索其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　 方法：使用ICH和RT-PCR技術(shù)檢測p53對Ki-67基因表達的影響；雙熒光素酶活性檢測技術(shù)鑒定48小時內(nèi)Ki-67基因核心啟動子活性變化趨勢以及p53過表達對其轉(zhuǎn)錄活性的影響；瞬時共轉(zhuǎn)染實驗檢測p53過表達對Sp1所介導(dǎo)的Ki-67基因核心啟動子活性上調(diào)的影響；ConTra啟動子同源性分析系統(tǒng)檢測Ki-67基因核心啟動子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)

2、合位點；定點突變技術(shù)分別構(gòu)建p53結(jié)合模序和Sp1結(jié)合位點定點突變質(zhì)粒；瞬時共轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測技術(shù)鑒定Ki-67基因核心啟動子區(qū)p53結(jié)合模序和Sp1結(jié)合位點在p53過表達所介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性抑制中的作用。
　　 結(jié)果：p53過表達顯著抑制Ki-67基因的表達。48小時內(nèi)Ki-67基因核心啟動子的活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其中在24小時時達高峰。p53以劑量依賴的方式下調(diào)Ki-67基因核心啟動子的基本轉(zhuǎn)錄活性。ConTra

3、啟動子同源性分析系統(tǒng)在Ki-67基因核心啟動子區(qū)檢測到兩個p53結(jié)合模序。定點突變技術(shù)成功構(gòu)建出3個p53結(jié)合模序突變質(zhì)粒和3個Sp1結(jié)合位點突變質(zhì)粒。p53結(jié)合模序突變后的Ki-67核心啟動子活性較突變前有所上調(diào)，但仍受p53的抑制。p53以劑量依賴的方式抑制Sp1介導(dǎo)的Ki-67基因核心啟動子活性的上調(diào)。隨著核心啟動子中Sp1突變位點數(shù)目的增加，Ki-67基因核心啟動子的基本轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，而p53對其的抑制作用也相應(yīng)減弱，當3個

4、Sp1結(jié)合位點全部突變后p53幾乎失去了對其的轉(zhuǎn)錄抑制活性；當核心啟動子區(qū)的第一個和第三個Sp1結(jié)合位點突變后，啟動子的轉(zhuǎn)錄活性較突變前有所上調(diào)。
　　 結(jié)論：p53過表達通過p53和Sp1依賴的途徑抑制Ki-67基因核心啟動子的基本轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)Ki-67基因的表達：1．p53通過與p53結(jié)合模序的序列特異性相互作用發(fā)揮對Ki-67基因核心啟動子的部分轉(zhuǎn)錄抑制活性；
　　 2．Ki-67基因核心啟動子區(qū)的第1個和第3個