Ki67基因啟動(dòng)子克隆及其核心功能區(qū)域鑒定.pdf

1、目的: 克隆Ki67基因啟動(dòng)子并鑒定其核心功能區(qū)域的活性及腫瘤特異性。 方法: 以EcoR I酶過(guò)度酶切的腎癌Ketr-3細(xì)胞基因組DNA為模板，使用PCR的方法獲取Ki67基因5'側(cè)翼序列，測(cè)序正確后插入pGL3-Basic載體。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)鑒定其啟動(dòng)子活性及腫瘤特異性。使用缺失分析法分別從Ki67基因5'側(cè)翼的5'端和3'端逐段缺失，克隆得到不同長(zhǎng)度的截短片段，插入pGL3-Basic載體，使用雙熒光素酶檢

2、測(cè)系統(tǒng)定位Ki67基因啟動(dòng)子核心功能區(qū)域，鑒定其啟動(dòng)子活性及腫瘤特異性。 結(jié)果: 克隆到的Ki67基因5'側(cè)翼序列與Genbank中記錄完全一致，其啟動(dòng)子活性在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞四種人腫瘤細(xì)胞內(nèi)分別達(dá)到SV40 promoter/enhancer活性的21.0％、31.1％、23.9％和7.2％；在人正常Huvec細(xì)胞內(nèi)僅為0.5％。自5'端缺失的截短片段其活性表現(xiàn)為先升高后降低，在H

3、ela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞內(nèi)，-223～+771截短片段的活性達(dá)到峰值，分別為SV40 promoter/enhancer活性的18.2％、56.5％、44.1％和13.2％；自3'端缺失的截短片段均表現(xiàn)出較缺失前更強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，-223～+30截短片段的活性在Hela細(xì)胞、BIU-87細(xì)胞、Ketr-3細(xì)胞、A549細(xì)胞內(nèi)分別為-223～+771截短片段活性的2.9倍、2.6倍、2.4倍、2.7倍，