稻瘟病菌一個(gè)新抗藥性標(biāo)記基因的應(yīng)用研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是生產(chǎn)中最具破壞性的致病真菌之一，每年可造成10％-30%的糧食產(chǎn)量損失。隨著稻瘟病菌及其宿主水稻全基因組序列測(cè)序工作的完成，加快了對(duì)病原菌致病性相關(guān)基因的研究進(jìn)程，同時(shí)也為研究宿主-病原菌相互作用提供了理論基礎(chǔ)。從分子水平解析稻瘟病菌致病及變異機(jī)制對(duì)有效防控該病害的發(fā)生及發(fā)展具有重要的理論與實(shí)踐意義。
　　目前，稻瘟病菌主要通過(guò)基因敲除、過(guò)表達(dá)和熒光蛋白融合等方法來(lái)進(jìn)行基因功能研究

2、。但是，大部分基因重組整合位點(diǎn)往往是隨機(jī)的，由此帶來(lái)的位置效應(yīng)可能會(huì)干擾基因自身或是相關(guān)功能基因的表達(dá)。本研究利用紫外線（UV）對(duì)稻瘟菌進(jìn)行輻射突變，獲得一株萎銹靈抗性菌株，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該突變菌株琥珀酸脫氫酶 B亞基（sdi1）第245位氨基酸發(fā)生突變。利用該點(diǎn)突變（H245L）作為篩選標(biāo)記，對(duì)已知載體 pCAMBIA1300進(jìn)行改造，使其成為具有萎銹靈抗性篩選標(biāo)記，并能定點(diǎn)插入Mosdi1位點(diǎn)的重組載體 pMoC-eGFP。通過(guò)農(nóng)桿菌

3、介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法得到 pMoC-eGFP定點(diǎn)重組的突變體，對(duì)抗性菌株進(jìn)行PCR及Southern雜交驗(yàn)證，表明該載體定點(diǎn)、單拷貝整合至基因組Mosdi1位點(diǎn)的效率高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變株在產(chǎn)孢量、孢子形態(tài)、生長(zhǎng)速率等方面與野生型菌株相比未發(fā)生明顯改變，同時(shí)，突變體對(duì)大麥和水稻（敏感品種CO-39）的致病性也未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。因此，可以將Mosdi1位點(diǎn)作為目的基因整合位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)目的基因在稻瘟菌株中的穩(wěn)定表達(dá)。此外，該載體包含酵母重組區(qū)，

4、可以不依賴限制性酶切位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)DNA片段的一步連接。與傳統(tǒng)基因回補(bǔ)及定位研究方法相比，該系統(tǒng)快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)稻瘟病菌基因功能研究具有重要的意義。
　　目前，本實(shí)驗(yàn)室利用該定點(diǎn)整合系統(tǒng)，完成了稻瘟菌Morak1、Mopmt2及Mokhd4三個(gè)基因的定點(diǎn)回補(bǔ)及定位載體構(gòu)建工作。上述部分菌株進(jìn)行Southern雜交及半定量RT-PCR驗(yàn)證，表明突變體中目的基因均以單拷貝形式整合在Mosdi1位點(diǎn)下游。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，在上述系